Completo Recuperando esporos 2007 - Cultivo Orissa, Taz, Pesa,TKSS e Cambodian

RECUPERAÇÃO DOS CARIMBOS
Ganhei muitos carimbos antigos de um amigo de 2007, 2008 e 2009. Com a esperança de recuperá-los apartir de cultura liquida e isolamento em Placa de Petri com Agar

Testei primeiro as Strains:
Pink Bufalo 2007
Cambodian 8/2009
Penis Envy 6 5/2008
Orissa India 01/2008
Mexican Tucun 8/2007
Dancing Tiger 5/2008
Oak Ridg 05/2008
Porto Rico 12/2007
Tazmanian 2009

6 de agosto
Os carimbos foram inoculados em meio de cultura liquido
- Com o uso de um Swab (cotonete longo estéril), coletei todo material do carimbo, coloquei em um tubo falcon de 15 ml, contendo 3 ml de meio de cultura, cortei com uma tesoura flambada a alça do swab, e homogenizei por 1 minuto.

Inoculação das placas de petri com meio de cultura agar
- Com uma pipeta pasteur (Pipeta que tem um bulbo, quando apertada o material entra) descartável de 3 ml, foi coletado 4 gotas dos esporos diluído no meio liquido, forma espalhadas na placa de petri , com esfregaço.

As placas e os tubos foram armazenadas em caixa de isopor, temperatura de 26 a 29ºC

Nenhum das placas ocorreu crescimento
Algumas placas houve crescimento de contaminantes
Na maioria dos tubos teve contaminações , contaminantes diferente, mas apareceu com maior frequência duende verde ( preciso estudar mais a identificação deles)

Passado quase um mês resolvi inocular o meio de novo com alguma esperança
Em 30 de agosto
Inoculei a cultura liquida novamente em placa de petri, mas somente de algumas strain:
Tazmanian, Cambodian, Pink Bufalo, Orissa India, Oak Ridge, Port Rico, Mexican Tucun e Penis Envy 6
Com cuidado para não pegar os contaminantes
Resultado
Mexican Tucun -Tem um pequena borda ao redor do esporo, parece que ira crescer algum dia
Penis Envy 6- Não cresceu nada ate o momento
Dancing Tiger - Não cresceu nada
Porto Rico - Não cresceu nada
Oak Ridge - esta crescendo, mas estou em duvida se e ele ou contaminante, vou aguardar mais um pouco para confirmar, mas 80% de chance de ser PC
Pink Bufalo- Esta iniciando o crescimento, mas não da para identificar ainda
Cambodian - Cresceu micelio, contaminação esverdeada e parece ter tido uma contaminação por Pseudomonas.
Tazmanian - Placa 100% colonizada
Orissa India- Colonizou 70 %, com 3 focos de contaminante

4 de agosto
Isolamento do Micélio em meio liquido:
- Isolei uma pedaço com uma ponteira , e coloquei dentro do falcon com meio de cultura
Fiz 3 Tazmanian, 2 Orissa e 1 Cambodian
Todos tiveram crescimento de micelio, mas irei testar o cambodian em placa de petri, pois a placa dele havia muita contaminação.

As fotos das placas e meio de cultura liquido

 

[tupy]

Pelas fotos tá bem difícil o trabalho por ai, nada satisfatório até então. Mas eu sei que voce também já sabia que não ia ser fácil. Já tentou utilizar um pouquinho de carvão ativado? Talvez ajude. Se conseguir uma strain que for já vai ser uma vitória!

 

[Biolouka]

As primeiras placas que fiz não cresceu nada além de contaminação , que fiz as placas com os esporos em CL por 24 horas, aguardei quase 1 mês (por falta de tempo mesmo) e fiz as placas de novo, agora estão crescendo, mas alguns tem contaminantes ( Cambodian), que eu isolei em outro CL e vou plaquear de novo na segunda.
Mas para mim a maior Vitoria foi recuperar o Taz e o Orissa, cresceu micelio na placa e na cultura liquida isolada.
Estas 2 strains era minhas mais desejadas, o isolado do cambodian também cresceu micelio.
Na placa o porto Rico, Oak, Pink Buffalo estão crescendo também. Mas começo a viajar a trabalho no mês que vem e se tiver muita strain, vai ficar mais difícil, para pessoa que irá colher e secar para mim.
Guardei os tubos com esporos em meio liquido em geladeira e quando retornar, trabalho com elas
Mas as strain que deseja recuperar era Orissa, Taz e Penis Envy6, 2 aparentemente já consegui. Vamos ver os resultados do cultivo.


Preparo do meio
Milho

2 pacotes de milho
Água sanitária
calcário
Potes de vidro com tampa
Fita Microporo
pote grande
Panela com tampa
e secador
Autoclave


- Em um pote deixei de molho o milho por 24 horas com 2 colheres de água sanitária
- Lavei bem o milho, e deixei de molho em água com 2 colheres de calcário ( equilibrar PH) por 24 horas
- Em uma panela com água, cozinhei o milho por 30 minutos apos fervura
- Escorri o milho, sequei um pouco com secador de cabelo, e distribui em 8 vidros de tamanhos diferentes ( os que eu tinha, não tive tempo de ira traz para comprar mais vidros)
- Na tampa dos vidros fiz um furo e tampei com fita microporo na parte interna e externa
- Esterilização por autoclave a 121ºC por 20 minutos



PF TEK

3 copos Vermiculita seca autoclavada
1 1/2 copo de Farinha de arroz integral
2 colheres cremogema
1 colher de calcário dolomítico
papel alumínio
1 1/2 copo de água filtrada
5 copo tipo de requeijão
Pote
Fita Crepe


- Triturei o arroz integral no liquidificador
- misturei em um pote todos ingredientes secos, homogenizei e acrescentei água, misturei novamente.
- deixei uma camada fina de vermiculita no fundo dopo
- coloquei o meio nos copos e cobri uma fina camada de vermiculita
- fechei os copos com papel alumínio ( dobrado em 3 partes) e lacrei com fita crepe
- coloquei uma camada de papel manteiga sobre o alumínio e prendi com um elástico
- Autoclavei a 121ºC por 20 minutos

PF Tek com sementes de pássaros


Resolvi fazer esta receita, para ver o rendimento

2 copos de vermiculita seca autoclavada
4 de sementes de pássaros
2 farinha de arroz integral
1 1/2 copo de água filtrada (usei a mesma água que cozinhei as sementes)
10 copos tipo requeijão
papel alumínio
Pote
Fita Crepe
Papel manteiga
elástico
vermiculita

- triturei o arroz no liquidificador
- cozinhei as sementes de pássaros com água filtrada por 30 minutos
- Escorri as semente guardei a água para o usar no meio, deixei as sementes secando por uns 30 minutos
- Misturei todos os ingredientes
- fiz uma camada fina de vermiculita no fundo do copo
- acrescentei o meio, cobri com uma fina camada de vermiculita
- lacrei os copos com papel alumínio dobrado em 3 camadas, lacrei com fita crepe
- cobri com papel manteiga e elástico
- Autoclavei a 121ºC por 20 minutos

Inoculação

31 de agosto

4 vidros de milho
CL de TKSS e Pesa
pipeta de pasteur descartável estéril de 3 ml

-Limpei a tampa do forno com água sanitária e álcool 70%
- deixei ligado por uns 20 minutos
- limpei todo o material com álcool 70%
- Com a pipeta inoculei 3 ml de CL em cada vidro 2 TKSS e 2 Pesa
- mantive em caixa de isopor com aquecedor temperatura de 24 a 29 cº

4 de setembro

10 copos com PK tek com sementes
5 copos com PK tek
Cultura liquida de Peza, TKSS e Taz
Estilete
fita microporo
pipeta de pasteur

- Limpei a tampa do forno e materiais com álcool 70%
- flambei o estilete e fiz 3 pequenos furos no alumínio, mantendo os copos próximo do fogo
- Com a pipeta, inoculei 3 ml de Cultura liquida em cada copo 7 Pesa, 7 TKSS e 1 TAZ( Taz é teste do isolamento)
- tampei rapidamente os furos com fita microporo, cobri com papel manteiga e elástico
- incubados em caixa de isopor temperatura de 24 a 29ºC

8 de agosto - Inoculação da cultura liquida dos carimbos recuperados

4 vidros de milho
Cultura liquida Taz, Orissa e Cambodian ( teste)
Pipeta

-Limpei a tampa do forno com água sanitária e álcool 70%
- deixei ligado por uns 20 minutos
- limpei todo o material com álcool 70%
- Com a pipeta inoculei 3 ml de CL em cada vidro, 2 de Taz, 1 Orissa e 1 Cambodian(vidro menor)
- mantive em caixa de isopor em temperatura ambiente

 

[Mortandello]

mas ta dando gosto de ver como vc pegou firme agora bio!
to todo orgulhoso de voce menina!

 

[Biolouka]

mas ta dando gosto de ver como vc pegou firme agora bio!
to todo orgulhoso de voce menina!

Valew Mortandello, fico muito feliz, vindo de vc, te considero como um dos meu mentores, que me auxilio bastante, mesmo quando fico brava contigo, depois passa, hoje vc me da menos puxão de orelha, mas teve uma epoca q tu era tipo trip de pesa, daquelas q é so tapa na cara, mas depois vem um grande ensinamento... rsrsr
Valew mermo

 

[Mortandello]

quem ama, cuida.
e lembra aquele ensinamento antigo, a boca que te beija hoje amanha te cospe, e a mao que afaga te esbofeteia?
ta fazendo tudo certinho sim e merece reconhecimento.
bem como quando fazia as coisas erradas merecia correcao.
eh sentimento paternal isso amiga.

 

[Biolouka]

Meio de cultura liquida

Extrato de levedura
Proteose Peptona
Casaminoacido
Dextrose
Amido Soluvel
Piruvato Sodico
Fosfato de Potassio bibasico
Sulfato de Magnesio
Agua ionizada - Milli

PH 7,2

O meio das placas é acrescentado agar

 

[Z-Boo]

Quantas strains!!! Jamais chegarei nesse nível de cultivo, mas é bom sabe que pessoas como vc trabalham pra manter as strains vivas e cultiváveis!

 

[SILVIOX]

A biolouka é nossa salvadora , ta recuperando uns strains muito boas!!! Que os espiritos dos cogumelos,te deem muita luz e saudações

 

[Biolouka]

Bem...
O vidro de milho do Taz e Cambodian, apareceram contaminação.
O vuidro do Orissa apareceu micelio... huhuhu - Orissa com carimbo de janeiro de 2008 com contaminação - Foi isolado e recuperado- CL pronta ao que parece, mais uns dias so para confirmar

O Taz e o cambodian, inoculei a Cl que usei em placa de petri, para reisolar novamente o micelio... desta vez vai...

 

[Mortandello]

Isso ae guria!
te esforcando ao maximo. assim que eu gosto (cafune na cabeca)...

 

[Biolouka]

Meu maior objetivo é recuperar principalmente os carimbos das strains que não estão disponiveis na Profungos, se não me engano tenho umas 3 strains que não estão disponiveis, alem destas q estou recuperando devo ter uns carimbos de mais 5 que não mexi ainda, que este ano não terei tempo, por conta de trabalhos academicos de campo, mas no proximo semestre quero dar minha contribuição em carimbos, para auxiliar, quero constribuir um pouco, uma forma de agradecer tudo que aprende aqui e com os magicos, e que venha mais cultivadores...

 

[Biolouka]

Triste, mas naum desisto
Fui ver as placas e os potes, e VERDE... p...q...p
Amanha começo denovo... tenho muita fe de salvar pelo menos o Orissa e o Taz... é um querer tâo grande, q a unica coisa q naum penso é desistir...
Pela forma que ocorreu as coisas, os carimbos tinham o contaminante, que esta muito mais forte que o PC, e ta ganhando na competição, mas ei de pegar a gotinha certa...

 

[Mortandello]

pode ser que os esporos da trich estejam DENTRO dos esporos dos pc. ae nao tem jeito mesmo.

 

[Cosmik]

pode ser que os esporos da trich estejam DENTRO dos esporos dos pc. ae nao tem jeito mesmo.

Concordo, já aconteceu comigo ao tentar isolar a strain Australia, 5 placas e 5 CL's todas com trich. Terrível.

Aproveitando o post, peço humildemente: Galera, vamos nos dedicar um pouco mais na assepsia durante a carimbada?! O próximo a receber um carimbo contaminado pode ser você! Pense nisso!

 

[Biolouka]

Vou diluir mais a CL e reinocular... vou continuar tentando...
Tenho mais uns carimbos, mas acho que ao invez de diluir o carimbo direto no meio liquido, vou diluir em agua mineral autoclavada por 48 horas e depois inoculo o Meio liquido com uma quantidade minima.
Vou ser mais cuidadosa e ter mais calma em cada etapa... logo publico as novidades.

 

[Mortandello]

Vou diluir mais a CL e reinocular... vou continuar tentando...
Tenho mais uns carimbos, mas acho que ao invez de diluir o carimbo direto no meio liquido, vou diluir em agua mineral autoclavada por 48 horas e depois inoculo o Meio liquido com uma quantidade minima.
Vou ser mais cuidadosa e ter mais calma em cada etapa... logo publico as novidades.

quanto maior a diluicao, mais chances de dar certo um isolamento com sucesso viu bio.

 

[tupy]

Concordo, já aconteceu comigo ao tentar isolar a strain Australia, 5 placas e 5 CL's todas com trich. Terrível.

Nem me fale, esse carimbo de Australia é famoso, já passou por aqui também
Mais fácil o canguru tossir.

 

[Biolouka]

Qual melhor agua usar, tenho agua esteril deionizada aqui, para diluir outros carimbos. Ou seria melhor eu autoclavar agua mineral ? A agua deionizada ta mais facil viu... na mão.. mas se a mineral aumentar minhas chances, faço com ela.

 

[tupy]

Qual melhor agua usar, tenho agua esteril deionizada aqui, para diluir outros carimbos. Ou seria melhor eu autoclavar agua mineral ? A agua deionizada ta mais facil viu... na mão.. mas se a mineral aumentar minhas chances, faço com ela.

Água mineral fervida, é a que vai ter mais nutrientes. Já usei água deionizada e não gostei.

Tente usar uma solução de ágar mais simples, talvez tenha mais sucesso. Amido e Peptona são bons para o micélio assim como são atraentes para os contaminantes.