Nota: Estas instruções são mais efetivas quando executadas em ambientes esterilizados o máximo possível. O método preferido envolve seguir os passos abaixo enquanto se trabalha em uma glovebox limpa e esterilizada. Há muitos métodos simples de construção de gloveboxes, muitos se encontram em sítios sobre cultura na internet. Se você não deseja construir uma glovebox, ou não tem uma, os seguintes passos podem ser adaptados com sucesso usando a "técnica do forno". Essa técnica usa o forno como um modo de reduzir quantidade de contaminantes presentes. Para isso aqueça o forno e abaixe a tampa. Você então usará a tampa do forno como superfície de trabalho. A teoria é que o calor do forno faz com que contaminantes do ar sejam levados para longe, já que o ar quente sobe, assim prevenindo que caiam na sua superfície de trabalho.
1. Encha a panela com água mineral ou destilada
2. Ferva a água por no mínimo dez minutos, isso deve ser suficiente para esterilizar e limpar a água de todas as bactérias e vírus.
3. Pegue sua seringa e encha-a com a água fervendo. Deixe assim por dois minutos.
4. Jogue a água da seringa fora (não de volta na panela).
5. Repita os passos 3 e 4 por mais duas vezes. Na terceira vez mantenha a água quente na seringa.
6. Guarde a seringa num local fresco e seco, preferivelmente em um ziplock limpo.
7. Deixe esfriar por várias horas antes de prosseguir para o Procedimento Dois.
1. Primeiro limpe sua área de trabalho. Isso envolve limpar toda as superfícies de trabalho com uma solução diluída de limpeza (água sanitária) e borrifar a área com um desinfetante como Lysol.
2. Ponha os seguintes materiais na sua glovebox ou na tampa do forno. O recipiente de vidro (copinho de cachaça), a seringa fria, o pote de álcool isopropílico, uma toalha de papel, o carimbo de esporos (ainda guardado) e um isqueiro ou chama de álcool.
3. Lave as mãos com sabonete antibactérias (Protex).
4. Dobre o papel toalha em quatro seções e embeba um canto com álcool.
5. Com o papel toalha embebido em álcool, limpe o interior do recipiente de vidro, esterilizando essencialmente a superfície que será usada para a transferência. Deixe o recipiente secar, alguns poucos segundos são suficientes.
6. Remova a tampa de proteção da seringa e ponha a agulha no fogo para esterilizar. Então com o papel toalha limpe a agulha para ajudar na esterilização. Nesse ponto tente evitar que a agulha toque outra superfície.
7. Nota: É importante neste ponto trabalhar o mais rápido possível para diminuir as chances de contaminantes caírem na área de trabalho e de algum modo irem para a seringa.
8. Abra o carimbo. Suavemente comece a raspar, com a agulha da seringa, uma seção do carimbo para dentro do recipiente de vidro. Para um carimbo médio geralmente é adequado raspar não mais que 1/5 do carimbo.
9. Você terá uma pequena e notável coleção de esporos no recipiente. Agora solte não mais do que metade da água da seringa no recipiente, misturando os esporos na água.
10. Sugue a solução de esporos para dentro da seringa. Faça isso mais algumas vezes para permitir que a maior quantidade de esporos seja absorvida.
11. Uma vez dentro da seringa pode-se notar que a água se tornou mais escura e você poderá ver blocos de esporos flutuando na solução. Isto é bom: você completou o processo. (A água em alguns casos pode permanecer da mesma cor. Basta alguns blocos de esporos serem visíveis para que a seringa seja viável).
12. Esterilize novamente a agulha com o papel toalha, coloque o protetor da agulha e ponha a seringa num ziplock limpo.
13. Deixe a seringa guardada por no mínimo 12 horas antes de usá-la para inoculação. Isso é extremamente importante, já que os esporos devem hidratar antes de serem introduzidos em substratos. Falha nesse processo pode resultar em germinação lenta ou inexistente.
Materiais necessários:
- Seringas vazias esterilizadas
- Panela
- Álcool isopropílico
- Papel toalha
- Um isqueiro ou chama de álcool
- Um recipiente de vidro (copinho de cachaça cai bem)
Procedimento Um: Fazendo uma seringa esterilizada
1. Encha a panela com água mineral ou destilada
2. Ferva a água por no mínimo dez minutos, isso deve ser suficiente para esterilizar e limpar a água de todas as bactérias e vírus.
3. Pegue sua seringa e encha-a com a água fervendo. Deixe assim por dois minutos.
4. Jogue a água da seringa fora (não de volta na panela).
5. Repita os passos 3 e 4 por mais duas vezes. Na terceira vez mantenha a água quente na seringa.
6. Guarde a seringa num local fresco e seco, preferivelmente em um ziplock limpo.
7. Deixe esfriar por várias horas antes de prosseguir para o Procedimento Dois.
Procedimento Dois: Transferindo esporos do carimbo para a seringa
1. Primeiro limpe sua área de trabalho. Isso envolve limpar toda as superfícies de trabalho com uma solução diluída de limpeza (água sanitária) e borrifar a área com um desinfetante como Lysol.
2. Ponha os seguintes materiais na sua glovebox ou na tampa do forno. O recipiente de vidro (copinho de cachaça), a seringa fria, o pote de álcool isopropílico, uma toalha de papel, o carimbo de esporos (ainda guardado) e um isqueiro ou chama de álcool.
3. Lave as mãos com sabonete antibactérias (Protex).
4. Dobre o papel toalha em quatro seções e embeba um canto com álcool.
5. Com o papel toalha embebido em álcool, limpe o interior do recipiente de vidro, esterilizando essencialmente a superfície que será usada para a transferência. Deixe o recipiente secar, alguns poucos segundos são suficientes.
6. Remova a tampa de proteção da seringa e ponha a agulha no fogo para esterilizar. Então com o papel toalha limpe a agulha para ajudar na esterilização. Nesse ponto tente evitar que a agulha toque outra superfície.
7. Nota: É importante neste ponto trabalhar o mais rápido possível para diminuir as chances de contaminantes caírem na área de trabalho e de algum modo irem para a seringa.
8. Abra o carimbo. Suavemente comece a raspar, com a agulha da seringa, uma seção do carimbo para dentro do recipiente de vidro. Para um carimbo médio geralmente é adequado raspar não mais que 1/5 do carimbo.
9. Você terá uma pequena e notável coleção de esporos no recipiente. Agora solte não mais do que metade da água da seringa no recipiente, misturando os esporos na água.
10. Sugue a solução de esporos para dentro da seringa. Faça isso mais algumas vezes para permitir que a maior quantidade de esporos seja absorvida.
11. Uma vez dentro da seringa pode-se notar que a água se tornou mais escura e você poderá ver blocos de esporos flutuando na solução. Isto é bom: você completou o processo. (A água em alguns casos pode permanecer da mesma cor. Basta alguns blocos de esporos serem visíveis para que a seringa seja viável).
12. Esterilize novamente a agulha com o papel toalha, coloque o protetor da agulha e ponha a seringa num ziplock limpo.
13. Deixe a seringa guardada por no mínimo 12 horas antes de usá-la para inoculação. Isso é extremamente importante, já que os esporos devem hidratar antes de serem introduzidos em substratos. Falha nesse processo pode resultar em germinação lenta ou inexistente.
