Visão geral:
Com este método nós iremos criar uma seringa limpa e livre de contaminantes. A seringa será preenchida com água quente e esterilizada e depois irá resfriar. Os esporos serão transferidos do "carimbo" de esporos na solução da seringa usando um shot glass [ex.: copinho de tomar shots de pinga, taças de champanhe]. Ao completar esta Tek, você terá criado uma seringa com solução de esporos pronta para usar em qualquer aplicação de microscopia.
Nota: Estas instruções são mais efetivas quando feitas no ambiente mais estéril disponível. O método preferido envolve seguir os passos abaixo enquanto trabalha em uma glovebox limpa e estéril ou em frente a uma capela de fluxo laminar. Existem muitos métodos simples de construção de uma glovebox; a maioria está disponível na web em sites populares de cultura micológica. Se você não deseja construir uma glovebox, ou não tem uma, os passos seguintes foram feitos com sucesso ao se trabalhar em uma superfície completamente limpa e desinfetada. Uso liberal de desinfetantes e água sanitária diluída é recomendada para limpeza e desinfecção da área de trabalho.
Materiais necessários:
- Seringas vazias e estéreis
- Panela de cozinha
- Álcool
- Papel toalha
- Um isqueiro ou chama disponível
- Um shot glass (copo pequeno, de boca fechada e relativamente alto com o fundo do copo redondo)
- Um print (carimbo) estéril
Procedimento 1 - fazendo uma seringa estéril:
1. Encha sua panela com água de torneira ou água destilada. (Use água destilada se sua água de torneira contém altas quantidades de minerais e substâncias químicas indesejáveis [ex.: cloro]).
2. Ferva a água no pote em fogo alto por no mínimo 10 minutos. Isto deve ser adequado para esterilizar e limpar a água de todas bactérias, vírus e esporos de bolores.
3. Pegue a sua seringa vazia e encha com a água fervente. Permita que fique por 2 minutos com a água quente dentro. (Se sua seringa já veio esterilizada e lacrada, pule os passos 4 e 5).
4. Despeje a água quente da seringa em uma pia, não jogue de volta na panela.
5. Repita os passos 3 e 4 mais duas vezes. Na segunda vez deixe a água quente na seringa.
6. Coloque a seringa em um lugar fresco que não pegue correntes de ar, preferencialmente em um saco ziplock limpo.
7. Permita que esfria por diversas horas antes de seguir ao procedimento 2.
Procedimento 2 - transferindo os esporos do carimbo à seringa:
1. Primeiro limpe sua superfície de trabalho. Isto implica em passar um pano com água sanitária diluída e espargir a área com desinfetantes como Lysol (ou mesmo álcool).
2. Coloque os seguintes materiais em sua glovebox ou na superfície limpa de trabalho: o shot glass, suas seringas resfriadas, a garrafa de álcool, um papel toalha, seu print (ainda fechado em seu saquinho) e o isqueiro ou chama disponível.
3. Lave as mãos com sabão bactericida antes de seguir adiante.
4. Dobre o papel toalha e molhe um pedaço dele com álcool.
5. Com o papel toalha encharcado de álcool limpe o interior do shot glass, essencialmente esterilizando a superfície que você está para usar na transferência. Permita que o shot glass seque - deve demorar apenas alguns segundos.
6. Remova a proteção da agulha da seringa estéril e esterilize a agulha na chama - o que chamaremos a partir de hoje de flambar a seringa na chama. Então pegue seu papel toalha úmido de álcool e limpe a agulha para ajudar ainda mais na esterilização. Tente evitar que a agulha encoste em qualquer outra superfície a não ser que seja instruído para fazer tal.
7. Nota: é importante neste momento trabalhar o mais rápido possível para ajudar a combater as chances de bolores e bactérias contaminantes caiam em sua superfície de trabalho e estrague sua seringa.
8. Remova o carimbo do saco onde está guardado. Desdobre e exponha os esporos. Levemente comece a raspar, usando a agulha da seringa, uma parte do print para dentro do shot glass. Para um print de tamanho médio é normalmente adequado raspar uma seção não maior do q 1/5 do print total. (É importante inclinar um pouco a agulha na hora de raspar ao invés de usar a ponta, se não rasga o alumínio ou papel e também acelera todo o processo de raspagem).
9. Você irá ter um acúmulo notável de esporos no shot glass. Agora jogue não mais do que metade da água da seringa no shot glass, sacudindo levemente os esporos na solução. (Eu já prefiro jogar um jato de água com bastante força nos prints que estarão dentro do shot glass).
10. Chupe a solução de água de esporos na seringa. Você pode precisar jogar mais água no shot glass para re-chupar e assim capturar ainda mais esporos na seringa.
11. Uma vez que você tem a solução de esporos na seringa você deveria notar que a água dentro se tornou levemente tingida e você pode ver pequenos núcleos de esporos flutuando na solução. Isto é bom, você completou o processo.
12. Esterilize a agulha novamente com o papel toalha encharcado de álcool (e flambe também já que tá nessa), recoloque a guarda da agulha e coloca a seringa de volta no saco ziplock limpo.
13. Permita que a seringa descanse por não menos que 12 horas antes de usar em aplicações de microscopia ou para inoculação de variedades comestíveis. Quanto mais velho o print usando, mais desidratado os esporos estarão. Para observação e germinação para microscopia, os esporos irão precisar de tempo para reidratar.
Nota:
Cygnus X 1 disse:
- Fonte
- Sporeworks - Sporeworks.com
