Completo Clonegu #2, o Fim de um Isolamento via CL - MDK PF Tek (Diário 18)

Tek Usada:​

Bem, bora simplificar: tudo feito no padrão PF Tek.

Eis os tópicos com os tutoriais pra todas as fases do cultivo (que vão gerar o tão mas ainda não lançado guia-simplificado de PF Tek atualizado):

1. Destaque - Atualização PF Tek 2020 - Substrato
2. Tutorial - Atualização PF Tek 2020 - Inoculação
3. Tutorial - Atualização PF Tek 2020 - Feitura do Terrário de Garrafa Pet
4. Tutorial - Atualização PF Tek 2020 - Do Aniversário à Colheita
5. Atualização PF Tek 2020 - Secagem, Conservação e Consumo
6. Tutorial - Atualização PF Tek 2020 - Feitura de Carimbo e Seringa

Na feitura do substrato:​

• Não usei máscara, nem álcool, nem luva, nem touca, nem nada. O substrato será submetido a autoclave, não tem porque ter preocupação com assepsia na hora de fazer o substrato. Basta a mesma higiene que você teria cozinhando pra si mesmo. Por fim, tapei os copos com tampas de requeijão furadas do cultivo anterior.
• Não se preocupe se tiver ferrugem dentro das tampinhas porque o Cubensis adora ferrugem, come ela e forma um micélio bem consistente.
• Após a vedação - que não é hermética nem de nível empresarial e não evita então a troca de ar e umidade entre o interior do copo com o da PP. Assim, por qualquer argumento que seja, ocorre a autoclave lá dentro, mesmo que não haja furos em cima do vedamento.
• E, claro, nos furos coloquei micropore pra ajudar na hora de tirar da PP a não contaminar, assim como a...
• Camada de vermiculita. Ela tem duas funções: ajuda a não contaminar na inoculação/colonização e ajuda na fase de frutificação também pra apoio e também como área de maior pinagem em bolos mais secos. Entre outros benefícios, procurem sempre ter a camadinha de vermiculita.

--> isso aí, mistura primeiro a vermiculita com água. Depois então a FAI. Pega uma colher e enche os copos. Aí completa com vermiculita pura. Limpa as beiras com o dedo mesmo. Depois faz a vedação que quiser dos copos.

Feitura das Seringas e Inoculação​

Bem, lá nos idos de 2016 eu resolvi fazer uma Cultura Líquida com vistas a gerar uma tentativa de isolamento. Pra isso, ela teria que pelo menos passar por 2 ou 3 clonagens. A primeira não sei se fiz diário, mas a segunda registrei neste diário: Completo - CLonegu #1 - Clonagem simples via CL - MDK - PF Pet Tek - 13º Cultivo, datado do ano passado. E aí o passo final pra parar de tirar CLs e finalmente ter os carimbos "bombados" de um bom (quase?) isolamento de uma genética que já era top.

É hora da colheita! Pela terceira vez, kkk, mas chegou!

Pra quem tiver dúvida sobre conservação de genética, a dica é Cultura Líquida. O micélio fica vivo sem prazo definido dentro da geladeira e sobrevive por anos. Foi graças a isso que não perdi essa genética, pois sou muito preguiçoso e não me mantive recultivando durante um certo período.

1 - FEITURA DAS SERINGAS
--> primeiro, quero contar que descobri que existem agulhas maiores e mais grosas do que as nossas queridinhas rosadas: as brancas!!! Elas fazem um micélio ir e vir com a maior facilidade da CL para dentro da seringa, e da seringa pra dentro dos copos!!! É muito rara de achar, mas se acharem, e forem fazer CL, comprem, vale muito a pena pra simplificação. Já pra seringas feitas de carimbos, a ponta rosa está mais que suficiente, pois não há blocos de micélio, apesar os esporos microscópicos.
--> e aqui as 3 seringas feitas da CL que é amarela porque foi feita com mel. A cor do micélio também fica afetada por estar dentro do mel há tanto tempo, mas é Cubensis saudável (edit: na verdade, além do cubensis também se desenvolveram contaminantes que vieram junto com o cogumelo seccionado pra fazer a CL). Mesma coisa ocorreu com a CL anterior, e deu tudo certo. Fiz então logo 3 seringas. Usei uma e meia pra 6 copos - um exagero, mas tudo bem, tenho de sobra e como não é ME, não vai gerar grande disputa do substrato por muitas eclosões.

Como podem ver, tudo de assepsia eu faço em cima da tampa da boca do forno ligado do fogão. Neste caso, foi a estreia desse novo fogão, que esquenta que só o capeta kkkk mas ok, bora lá!

2 - INOCULAÇÃO DOS SEIS COPOS
--> os copos já inoculados, datados (não precisa colocar MDK porque são todos iguais) e com uma nova camada de micropore nos furos que foram reabertos pela seringa. As seringas que restaram foram embrulhadas em papel alumínio para armazenamento. E a CL foi novamente vedada, fechada num saco plástico e devolvida à geladeira, onde vive desde o ano passado com sua CL da geração anterior.

Entre a feitura do substrato e a inoculação se passaram 8 dias porque sou de fato preguiçoso. O lado bom é que nesse período qualquer contaminante interior já teria eclodido. Agora, se algum contaminante surgir, será pelas seringas ou pelo local de incubação.

Bem, o processo de inoculação foi então simples:

• Uso de máscaras, luva e toucas cirúrgicas após colocar os micropores já cortados na parte superior do fogão pra facilitar na hora de os colocar após inocular;
• Panelas limpas em superfície com álcool e abertas sobre a tampa do forno para que os copos saíssem já no ambiente relativamente controlado do local de trabalho asséptico;
• Flambagem das agulhas antes do primeiro copo e antes de passar pro próximo copo. Usei novamente uma boca do fogão mesmo para aquecer a agulha até o avermelhamento. Antes de inocular, dava uns tapinhas na seringa embaixo até que o líquido saísse sem evaporar;
• Inoculação em dois pontos;
• Finalmente colocação da camada de micropore nova sobre a anterior que foi perfurada. Neste momento, retiro pelo menos as luvas para poder manipular o micropore sem sofrência.
• Datação dos copos.

E então pra geladeira-incubadora:
--> acabei de ligar ela ao colocar os copos inoculados. A luz embaixo é incandescente para aquecimento da geladeira, e coberta com alumínio pra que o aquecimento se dê melhor e mais uniforme.


E pronto! Agora é esperar até que os micélios comecem a se expandir e fiquem novamente visíveis. Neste caso, não há eclosão, pois inoculei micélio diretamente.

Até em alguns dias, galerinha!!!

ATUALIZAÇÃO 1 - PROBLEMAS NO PARAÍSO: TUDO CONTAMINADO. "E agora, quem poderá nos defender???" - "Palma, palma, não priemos cânico!!!" (sábia frase de Chapolin Colorado)​

Primeiro, eu adoro ver contaminantes. Eles são fungos e são lindos - exceto os bacterianos, que são feios e deviam se envergonhar de si mesmos.

Vejam nesta foto como ficaram os copos:
--> em um dos copos (segundo da esquerda pra direita), um lindo Penicillium que nunca tive, com sua maravilhosa cor azul. No quarto copo, um fungo superior que gera um micélio que lembra açúcar glacê, que normalmente aparece durante a frutificação, e deve ter sido dela que veio quando seccionei o cogumelo pra CL. E, fora o Penicillium, nenhum mofo, o que nos abre algumas oportunidades de recuperação e isolamento. (Não tentem recuperar copos infectados! Lembrem que este cultivo visa o fim de um isolamento, e não a frutificação pra colheitas - e que já tenho 6 anos de experiência de cultivo).

Bem, qual a fonte da contaminação? A seringa, ou seja, a Cultura Líquida, pois todas as contaminações eclodiram nos pontos de inoculação. O cogumelo de que tirei o seccionamento provavelmente veio com o contaminante. Não fui muito cauteloso na hora de fazer, e deu nisso. Parte da prova é a existência do fungo que normalmente só acho em frutificação (o "parece glacê"). São quase todos em sua maioria fungos superiores, ou seja, não deixam esporos nos copos porque não produzem cogumelos com FAI - eis que apenas o cubensis produz cogumelos em FAI.

Isto dito...

Como vou recuperar?

Da mesma forma que alguém isola o cubensis de contaminantes em Placas de Petri, mas farei com seccionamento de trechos dos micélios saudáveis em um dos copos:

--> vejam aqui, em parte da inoculação, o cubensis se desenvolveu robustamente o suficiente para ter trechos seccionáveis que serão colocados...

--> ... que serão colocados nesses spawns de milho que estão na PP neste momento em que vos falo.

Como esterilizarei os milhos? Autoclave de 45 minutos na PP após ter pego pressão, e somente.

E depois?

Depois é pegar os spawns, aqueles que estiverem saudáveis, e inocular, talvez, no primeiro bulk da minha vida, ou quem sabe em PF Tek mesmo. Ou quem sabe nem isso... faço logo um casing com os milhos e tiro os carimbos pra finalizar o procedimento de isolamento. (Bolos de milho não são bons pra frutos, só casing de milho que presta um pouco - lembrem que quero apenas carimbos e não biomassa pra colheita).

O mais interessante é que sem querer as contaminações me forçaram a fazer algo que é comum em isolamentos: o seccionamento de trechos de micélios vigorosos. No caso, este trecho estará com todo o benefício do isolamento feito há 3 gerações anteriores em 2015, mais o fato de que se deu muito bem contra um contaminante caseiro comum.

É isso aí. Desistir jamais. Mas sou preguiçoso, que já era pra eu ter feito isso há duas semanas... mas minha prática em manter, observar e admirar contaminantes (tenho copos contaminados sob observação há mais de 1 ano) me fez ficar tranquilo pra entender a dinâmica depois que o substrato é todo colonizado o suficiente pra saber que ainda está a tempo.

Acabou que este diário pode ficar mais interessante ainda do que inicialmente proposto.

Vamos que vamos né! Em direção aos carimbos da super-genética MDK, e avanteeee.

Retorno em algumas semanas.

ATUALIZAÇÃO 2 - SECÇÃO DO MICÉLIO SAUDÁVEL PARA INOCULAÇÃO DO ISOLAMENTO NO SPAWN - COLOCAÇÃO DO RESTANTE DO BOLO EM GARRAFA PET PARA FRUTIFICAÇÃO​

É, já voltei kkk apesar de tanta preguiça da vida, vou viajar amanhã pelo fim de semana, então já fiz logo, e inoculei o spawn de milho que já tinha autoclavado há 3 dias.

E vamos aos detalhes. Como dito, o copo continha um micélio de cubensis dominante sobre a contaminação e estava perfeitamente viável.
--> fiz os seccionamentos da parte do bolo sem contaminante, verificando a cada corte se estava com micélio de cubensis puro. E então espalhava os pedacinhos sobre o milho.
--> em um dos seccionamento peguei um pouco do contaminante, como se pode ver pela mancha escura no bolo neste ângulo da foto. Claro que esse pedaço foi descartado. Aí eu substituí a faca, pra não contaminar os cortes futuros, que cortava, pelo estilete - que por sinal se mostrou bem melhor pra cortar os pedaços. Daí pra frente não teve mais pedaço com contaminação.

Tudo sendo feito na tampa da boca do forno do fogão ligado, como podem ver. O material foi esterilizado com álcool 70%, que foi espargido longe do fogão e então os materiais foram depositados na área de trabalho da capela de fluxo laminar caseira (a tampa da boca do forno do fogão, quando o forno está ligado). Também usei máscara, touca cirúrgica e luvas até o fim das inoculações do spawn.

E então ficou assim:

--> uma camada de micélio saudável sobre o spawn...

--> ... que após ser bem agitada, ficou espalhada pelo spawn pra agilizar a colonização.

--> e finalmente os copos foram colocados na geladeira-incubadora, onde ficarão morninhos no frio e amenizados no calor.

Mas houve um possível pequeno problema: não sei se o milho amoleceu o suficiente pra ser colonizado.

Em compensação, uma enorme e agradável surpresa:

--> o restante do bolo estava tão dominante de micélio de cubensis, e com demonstração de nós miceliais quase virando pinos, que então resolvi colocar pra frutificar! No caso de eu ter apenas um carimbo deste bolo, o isolamento via CLs terá finalmente se concluído após tantos anos! (Lembrando que os anos ficam por minha conta de ser preguiçoso kkk amém às CLs e sua longevidade absurda)

--> aqui em detalhe a parte mais saudável do bolo. No detalhe embaixo, um possível começo de pino.

--> aqui o detalhe do lado do bolo em que o contaminante ainda ficou visível. A sorte aqui é que o contaminante não é um mofo e o micélio deste copo colonizou numa taxa muito maior então praticamente o dominou por completo. E há algo que no encontro entre o cubensis e o contaminante que sequer gerou a "zona de conflito", aquele amarelado forte decorrente do forte excremento micelial que vem das enzimas da batalha contra o contaminante. Então, acho que eles estão "cada um na sua".

Logo, não haverá contaminantes nos carimbos dos cogumelos que crescerem nas zonas saudáveis dominadas pelo cubensis!

Sobre a feitura da garrafa PET, fiz com todos os cuidados possíveis, dadas as condições anormais em que o coloquei pra frutificar, com um contaminante estabilizado, dominado e não conflitante: argila expandida nova (eu normalmente aproveito entre cultivos as argilas após esterilizá-las), com boa limpeza, e uso de água oxigenada (que eu tenho abandonado nos últimos cultivos e colocado água normal desde o ano passado) no fundo até pouco mais que a metade da altura das argilas. Por fim, dentro da garrafa que foi bem limpa, atochei o bolo sem dó, como aprendi a fazer, pra dar aquela fixada nas irregularidades da base de argilas kkk.

Então, se o micélio não colonizar os milhos porque não ficaram moles o suficiente, as chances de que esse bolo vai me render o bendito e futuramente aclamado carimbo (ou carimbos) é de quase 100%.

--> por fim, o terrário de garrafa Pet foi posto no lugar que os micélios mais gostam: na janela da cozinha. Aqui, há um fluxo de vento que ajuda na troca gasosa mecânica independente de ação humana da Pet, e também pega uma boa parcela de luz. E como sempre, a forma de fechar a garrafa e não abrir buracos, com a ventilação apenas pelo perlon na tampa, assegura que haverá umidade adequada pelo fim de semana que ficarei fora.

Espero chegar de viagem e já ver quem sabe uns pinos. Mas tá tudo bem, sem pressa, sei que o bolo tem o tempo dele. E nós temos um caminho de 5 anos já juntos, essa genética e eu, desde que fiz a inoculação do carimbo em 2016. Então, nada de pressa agora.

É isso, galerinha, a magia dos Meninos Santos existe desde o cultivo, uma relação de amor que se forma e se estabelece, com eles que tenho como sacramento e que tanto me ajudaram em minha vida a superar vícios, doenças, obsessões e tantas coisas, e tanto ainda ajudarão.

Até a próxima atualização!

ATUALIZAÇÃO FINAL - COGUMELO NASCIDO E CARIMBO OBTIDO - SUCESSO DO ISOLAMENTO!!!​

E chegamos no tão sonhado carimbo fruto do isolamento! Uhuuuuuu

Vamos a uma timeline do nosso vitorioso e apenas ele necessário filho único:

--> cheguei da viagem na segunda a tarde

--> terça de manhã

--> quarta de noite

--> quinta-feira de manhã. Como podem ver, neste momento já é possível ver-se o cogumelo esporulando. A partir de quando esporular é que ele pode ser colhido pra tirada de carimbo. Se tirar antes do cogumelo começar a esporular, ele não esporulará e não formará carimbos.

Mesmo já esporulando, deixei ele crescer mais um pouco e abrir mais para dar um carimbo maior possível:

--> na primeira foto, o chapéu grandão depositado sobre o alumínio para carimbar dentro do potinho de cozinha virado pra baixo. Na segunda foto, o chapéu após ser retirado, depois de 24 horas carimbando.

Aí, considerei que o carimbo estava muito úmido pois o cogumelo deixou um rastro quando deslizou pro lado pra cair fora do potinho de cozinha. Por isso, deixei ele secando por 48 horas. Não há problema algum em deixar seu carimbo ainda em processo de secagem até por dias - ele apenas ficará mais seco, até não ter mais o que secar e entrar em equilíbrio com a umidade do ambiente, pois o potinho é suficiente pra evitar contaminantes mas não a troca de umidade com o ar.

--> e eis então o carimbo mais demorado pra ser tirado da história dos cultivos, pelo menos aqui do Teo kkk. Foi em 2016 que iniciei o primeiro isolamento da CL, que passou até aqui por 2 gerações, ao longo de 5 anos. E finalmente, o bendito.

Já sobre os spawns de milho feitos sem observar o detalhe que eles tinham que ser amolecidos:


--> deu nisso. Parece que o micélio se desenvolve bem, mas contaminantes de dentro dos milhos também. Mas não sei dizer, primeira vez que uso milho, então vou observar o desenvolvimento das colonizações.

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E é isso! Dou por concluído este diário e somente postarei novidades caso os spawns vinguem de alguma forma...

Finalmente tenho meu sonhado super-carimbo.

Próximos passos:

1. Tirar seringas deste carimbo;
2. Fazer copos PF Tek com este carimbo para tirar vários carimbos;
3. Distribuir a genética para todos no C&T.

E é isso! Grande abraço a todooooos. Fui,