Culturas do Insider

[Insider]

Boas...

Entao, ultimamente venho experimentando bastante com isolamento, mas nao tive muita sorte ate agora.

Bom o material e receita q eu usei pro composto foi:



-500ml de agua destilada
- 10 gr de Dextrose(acucar de uva) com vitaminas integradas.
- 10 gr de Agar Agar.
-umas 4 batatas medias + ou -(acho q da proxima vez vou usar mais porque me deu a impressao que podia ter sido mais denso o produto final).
-1gr de suplemento nutricional(Nutritional yeast)
-1 garrafa de vidro de refrijerante mate com um filtro tivec na tampa com um furinho previamente feito pra evitar q ebulicao do agar.
-papel aluminio.

Como nao tenho nenhuma balanca digital, usei o sistema de medidas por colheres.
Uma colher de cha de farinha sao mais ou menos 4 - 5gr, e como o agar agar tem uma densidade parecida com a farinha usei 2 colheres cheia de agar, e o mesmo pra dextrose.

Entao o que eu fiz foi, picar a batata bem pequeno e por pra ferver por 50 minutos a fogo baixo com 500ml de agua destilada e dei uma fervida final por uns 5 min:



Depois peguei uma vasilha de plastico e extendi um pano de cozinha e pus a batata fervida no pano pra filtrar o caldo sem nenhum pedacinho de batata:



Lavei a garrafa de vidro e com a ajuda de um funil coloquei as 10 gr de dextrose, 10gr de agar e 1gr de complemento, e na sequencia coloquei o caldo de batata que no final, pela evaporacao durante a fervura so encheu 60% da garrafa, entao tive que completar o resto com + agua destilada. Depois fechei com a tampa com um furinho e o filtro tivec bem firme, e depois coloquei aluminio tampando a boca da garrafa pra ajudar a evitar a ebulicao do agar.

Entao esterelizei na panela de pressao por 45minutos:



Entao esperei 2 horas apos a finalizacao da esterelizacao do agar, e neste meio tempo estive esterelizando meu set de trabalho, que no caso, é um banheiro limpo(limpo com anti-fungo/bactericida,sem janela com o minimo de ventilacao possivel e uma glovebox e tomei um banho, e escovei dentes e vesti roupa limpa cobrindo todo o corpo.

Material de inoculacao.



-20 petridishes compradas pre-esterelizadas.
-2 tipos de seringas, 1 Ecuador(um resto q eu tinha de um previo cultivo) e a outra uma strain de um colega que nao germinou nenhum prato(strain possivelmente bem fraca ou eu q fiz alguma coisa errada)
-parafilme
-luvas de latex
-spray de alcool de desinfeccao.
-rolo-papel de cozinha

Previamente antes de comecar eu recortei pedacos mais pequenos de parafilme(20 no caso), pois este tamanho(segue na foto) é ideal pra isolar as petridish sem desperdicar mto parafilme.



Gostaria de ter tirado fotos do processo de inoculacao mas o mais importante entao era trabalhar o maximo eficiente e rapido possivel,e tirar fotos durante nao seria a melhor ideia.

Mas basicamente o que eu fiz foi, levar a panela de pressao ainda sem abrir ate o banheiro, tirar o agar de dentro, entao dentro da glove box borrifando alcool e limpando tudo dentro da glovebox a cada passo q eu fazia tirei os pratos pre-esterelizados do saco, guardei o saco, depois chacualhei bem o agar antes de comecar a derramar nas petri, pra misturar bem o substrato que deceu no fundo durante o repouso.

Derramei o agar nas em 17 petri(nao deu pra enxer tudo ) empilhei as petridish cheias e coloquei cuidadosamente o saco cobrindo as petridish enquanto elas secassem.

Entao sai do banheiro e esperei mas umas 2 horas e meias ate q o agar estivesse completamente duro.
E comecei a inoculacao de pratos com seringas. Foram 2 gotinhas no centro de cada petridish.
Inoculei uns 12 pratos no total. Dos quais uns 8 eram ecuador e o resto a strain desconhecida q acabou nao germinando nada.

Depois disso fui selando petridish por petridish com os parafilmes pre-cortados. E coloquei todos pra encubar a 28°C

E no final ficou assim os pratos:



Agora vem a decepcao e a parte aonde vo pedir um conselho pra quem foi mais masterizado no assunto.
Segue as fotos dos pratos inoculados 1 semana e meia depois dos quais, só 6 me pareceram "interessantes".



Todas estas fotos ja tem 2 dias, e des de entao existe algum sinal de alguma raiz de micelio passando no meio daquela algodaozada toda. Mas minha pergunta é se vcs acham q isso pode ser aproveitado ainda ou melhor comecar denovo? O que eu ja fiz for pedir um carimbo de esporos de B+ e qdo chegar vou tentar inoculacao direto de esporos, porque de seringa ate agora to tendo bastante azar.

Agradeco a ajuda.

Até a proxima

 

[Paje]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

Excelente trabalho irmão.
prepara mais petri com bda e vai isolando o micelio... pega as partes mais risoformicas normalmente as pontas e passa para nova petri... assim vai isolando o micelio e fortalecendo...
paz

 

[Insider]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

Valeu paje, estou na esperanca deste ainda, mas pra mim o crecimento ta muito lerdo, demorou 2 semanas e ainda nao esta nem na metade do prato o micelio... é normal isso?? Ainda estou na duvida da dextrose de acucar de uva... Me disseram que o acucar de uva é mto acido e que tem q cozinhar ele antes de usar... alguem me poderia explicar o procedimento correto pra isso? Nao achei nada aqui no forum nem na net em relacao a isso... Sigo a procura de informacao.

PS: estou querendo seguir o conselho do Morta de usar cremogema mas aqui nao tem isso, existe algo parecido de trigo mas a cremogema tem varios nutrientes juntos q eu saiba q esse mingau de trigo aqui nao tem.

Valeu ai..

 

[Ecuador]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

Insider,

Se era dextrose pura pouco importa a fonte (dextrose = glicose).

E não é difícil encontrar dextrose por aí. Qualquer loja física ou online de suplementos tem.

 

[Insider]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

Insider,

Se era dextrose pura pouco importa a fonte (dextrose = glicose).

E não é difícil encontrar dextrose por aí. Qualquer loja física ou online de suplementos tem.

A dextrose é pura sim, na real é dextrose pura com vitaminas integradas pra suplemento humano.

Ps: alguem sabe me dizer qualo conteudo da cremogema? Se tem vitamina integrada ou se eh soh nutrientes do trigo?

Valeu o suporte de todos ai!

 

[tupy]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

A dextrose é pura sim, na real é dextrose pura com vitaminas integradas pra suplemento humano.

Ps: alguem sabe me dizer qualo conteudo da cremogema? Se tem vitamina integrada ou se eh soh nutrientes do trigo?

Valeu o suporte de todos ai!

Cremogena tem um monte de vitaminas, ideal para bebês.

Boa sorte na empreitada, acompanhando.

 

[Ecuador]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

Ps: alguem sabe me dizer qualo conteudo da cremogema? Se tem vitamina integrada ou se eh soh nutrientes do trigo?

Cremogema é uma farinha vitaminada.

Não é essencial. Os ingredientes que você usou vão suportar bem o micélio.

 

[Insider]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

Cremogema é uma farinha vitaminada.

Não é essencial. Os ingredientes que você usou vão suportar bem o micélio.

Sim eu sei, eu so queria saber pois o micelio adora transferencia pra novos meios.

Que pena qu enao tem isso aqui.. vou tentar procurar mingau multi-vitaminas pra bebe ou algo assim, imagino q deve funcionar igual.

Valeu ai denovo.

PS: Agora q notei q escrevi Isolacao em vez de isolamento no titulo, muda pra eu ai plizz? haha valeu

 

[tupy]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

Sim eu sei, eu so queria saber pois o micelio adora transferencia pra novos meios.

Que pena qu enao tem isso aqui.. vou tentar procurar mingau multi-vitaminas pra bebe ou algo assim, imagino q deve funcionar igual.

Valeu ai denovo.

PS: Agora q notei q escrevi Isolacao em vez de isolamento no titulo, muda pra eu ai plizz? haha valeu

Quanto mais vitaminas voce pretende colocar no meio bem maiores são as chances de contaminaçao.
Como o Ecuador falou não é essencial, na verdade é até dispensável.

 

[Insider]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

Quanto mais vitaminas voce pretende colocar no meio bem maiores são as chances de contaminaçao.
Como o Ecuador falou não é essencial, na verdade é até dispensável.

Verdade tupynambá

mas a ideia q eu tinha nao seria colocar tudo junto em 1 prato soh, e sim fazer diferente tipos de medias. O micelio adora essa variacao de medias, é como nos na verdade, comer soh feijao a semana inteira enjoa, mas variar no tipo de comida é mais gostoso hehe

Abraco

 

[Mortandello]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

seu pensamento esta certissimo insider.
nao se abale.

(ta dificil de eu achar alguma fonte confirmando que vitaminas sao consumidas por outras classes de fungos competidores aqui)
basicamente cremogema = maizena(amido) + ferro.
(as vitaminas ja sao inerentes ao amido de milho)
inclusive gostaria de salientar que CREMOAGAR eh uma otima midia para isolamentos, muito dificilmente ela contamina e pode inclusive ser desidratada com micelio VIVO pra ser "re-vivida" anos depois(ou congelada).

 

[Ecuador]

Isolacao de Ecuador e B+ com BDA e Complemento Nutricional

basicamente cremogema = maizena(amido) + ferro.
(as vitaminas ja sao inerentes ao amido de milho)

Sei não.

Se esse cornstarch (http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/cgi-bin/list_nut_edit.pl) for equivalente ao nosso amido de milho, não tem quase nada de vitamina.

 

[Insider]

Ae!!! demorou um pouco mas tenho alguns resultados apesar de poucos...

meus esporos de B+ chegaram deve fazer 1 semana e meia, entao dia 10/10 fiz 20 pratos de petridish seguinto a mesma receita da primera vez só que com + caldo de batata.

Como sempre tudo feito com o mesmo procedimento de assepsia da primera vez. Com um cottonete pre esterelizado na PP emvolto em aluminio, inoculei 12 pratos com esporos de B+, e fiz 8 transferencias de algum dos pratos de Ecuador aonde aparentemente apresentava pequenas sessoes rizos, a maioria cortado das pontas do micelio mas algumas sessoes tirei mais do meio tambem.

Os resultados ate agora(1 semana e 1 dia depois), nao sao nada de maravilha nao. Dos 12 pratos de esporos de B+ só 1 chamou a minha atencao e parece ter um pequeno foco de contaminacao surgindo perto do micelio:




PS: Essa foto ficou meio ofuscada

Os 11 resetantes de B+, a maioria deles os esporos nao germinaram e nao reagiram nada estranhamente.
O resto pelo que vejo aconteceu que 3 dias depois da inoculacao abrir a incubadora pra conferir as placas pra ver a situacao e a agua condensada no teto das placas cairam nos esporos e espalharam os esporos por todo o prato, e agora depois de 1 semana ao conferir pela segunda vez vejo q nesses pratos em vez de um ponto de inoculacao ta surgindo uma mancha branca de micelio gigante no prato todo, mas eh uma mancha muito fraca e quase nao da pra ver, a nao ser que ponha contr a a luz.


Agora falando da transferencia de Ecuador que eu fiz no mesmo dia da inoculacao dos B+. Dos 8 pratos só 3 das 8 sessoes transferidas reagiram ao novo mei resto está exatamente como quando eu transferi elas a 1 semana atras. E das 3 que o micelio reagiu, uma parece estar um pouco estagnado neste tamanho:



E as otras duas foram as que mais me chamaram a atencao e provavelmente vao ser as que vou usar para a segunda transferencia de Ecuador:

A segunda é essa, aonde da pra ver claramente a divisao entre 2 ou 3 familias, das 11h as 5h e a outra metade talvez umas 2 familias de flufy micelio.



A tercera é a que mais me chamou atencao de todas, apresentando sessoes rizomorficas bastante mais predominantes que na segunda, e espero poder tirar pelomenos umas 6, 7 sessoes.



Estou bastante otimista com essas, mas o B+ me deu poucos resultados ate agora, talvez é cedo ainda, vou esperar 1 semana mas pra ver o que acontece. Acho que com um pouco de paciencia deve funcionar...

Segue a foto de todos os pratos:







Ah queria perguntar se alguem puder me ajudar.

É normal que os esporos demorem tanto pra germinar?
Pode ser que muitos nao cheguem a germinar se quer?
É normal tb que algumas sessoes demorem + pra reagir ao novo meio ou nao reaga?


Valeu a todos!

 

[Insider]

ae hj depois de 4 dias, olhei outravez as placas, e continuam praticamente od mesmo jeito, as 2 placas que aparentam um micelio saudavel se expandiram um pouco, mas o resto das 17 placas estao estagnados no mesmo lugar alguem sabe se isso é normal? ajudem ae plz se der, valeu..

ps, estou pensando em fazer umas transferencias ja destas 3 placas q apresentam melhor micelio.

 

[Mauricio]

Basicamente todo procedimento está correto, alguns detalhes são importantes observar.
O mais importante é o tempo que você está esterilizando, 45 minutos é muito tempo, bastam 20 minutos e após esse tempo retire da panela de pressão assim que a pressão baixar.
A dextrose mantida em calor por longo periodo pode polimerizar, dai ao inves de dextrose o meio terá outro açúcar.
Algumas raças podem não evoluir tão rapidamente, se o açúcar for outro.
Se quiser use extrato de levedura para complemento, basta 0,2 g para cada 200 g de batata.
Prepare o caldo de batata ou de centeio.
Dissolva a levedura, previamente para não embolar, o agar, e a dextrose.
Junte tudo ao caldo e esterilize por 20 minutos.
Tire da panela e derrame nas placas.
Faça uma camada fina, 1 ou 2 mm no máximo, feche e espere esfriar.
Inocule no centro e guarde as placas de cabeça para baixo, para não pingar água no ágar.
Se a camada for muito grossa pode cair ao virar de cabeça para baixo.

 

[Insider]

Basicamente todo procedimento está correto, alguns detalhes são importantes observar.
O mais importante é o tempo que você está esterilizando, 45 minutos é muito tempo, bastam 20 minutos e após esse tempo retire da panela de pressão assim que a pressão baixar.
A dextrose mantida em calor por longo periodo pode polimerizar, dai ao inves de dextrose o meio terá outro açúcar.
Algumas raças podem não evoluir tão rapidamente, se o açúcar for outro.
Se quiser use extrato de levedura para complemento, basta 0,2 g para cada 200 g de batata.
Prepare o caldo de batata ou de centeio.
Dissolva a levedura, previamente para não embolar, o agar, e a dextrose.
Junte tudo ao caldo e esterilize por 20 minutos.
Tire da panela e derrame nas placas.
Faça uma camada fina, 1 ou 2 mm no máximo, feche e espere esfriar.
Inocule no centro e guarde as placas de cabeça para baixo, para não pingar água no ágar.
Se a camada for muito grossa pode cair ao virar de cabeça para baixo.

Nossa mauricio valeu mesmo kra!!! Nao sabia isso da dextrose polimerizar...(apesar do morta me ter dito algo sobre..) pensava que nao fazia diferenca pois no final dextrose = glicose.Talvez eu tenha sobrecozinhado a dextrose mesmo, na proxima vez vou deixar 20, 25 minutos no maximo. Vou tentar com extrato de levadura tambem, aqui nao tem q ser mto dificil de achar.

E uma coisinha qnao entendi, depois dos 20 min de pressao nao é melhor esperar esfriar antes de tirar da panela? o risco de infeccao nao aumenta consideravelmente?

Obrigadao pela dica kra! os: os:

abrax

 

[Mauricio]

Nossa mauricio valeu mesmo kra!!! Nao sabia isso da dextrose polimerizar...(apesar do morta me ter dito algo sobre..) pensava que nao fazia diferenca pois no final dextrose = glicose.Talvez eu tenha sobrecozinhado a dextrose mesmo, na proxima vez vou deixar 20, 25 minutos no maximo. Vou tentar com extrato de levadura tambem, aqui nao tem q ser mto dificil de achar.

E uma coisinha qnao entendi, depois dos 20 min de pressao nao é melhor esperar esfriar antes de tirar da panela? o risco de infeccao nao aumenta consideravelmente?

Obrigadao pela dica kra! os: os:

abrax

dextrose=glicose=glucose, são denominações diferentes para a mesma substancia.
O que pode ocorrer é o mesmo que ocorre quando você põe açucar na panela e aquece, vira calda de pudim.
A glicose é o açucar mais simples, os organismos utilizam a dextrose diretamente no seu metabolismo, é fonte de energia instantanea, por isso entra na receita, para o esporo reagir e eclodir, depois o que leva ao crescimento é a fonte de amido, que o organismo metaboliza transformando também em glicose.

Prepare o meio, conte 20 minutos na pressão e desligue o fogo. Deixe a pressão na válvula baixar, abra a panela próximo a glove e leve o frasco para dentro dela, derrame nas placas, cubra com a tampa ou filme, espere endurecer, inocule, feche e guarde de cabeça pra baixo. Não deixe pingar água no agar que estraga tudo.

Outra opção é esterilizar no microondas, é muito mais fácil, prático, rápido, confiavel, faz direto nas placas.

 

[Insider]

dextrose=glicose=glucose, são denominações diferentes para a mesma substancia.
O que pode ocorrer é o mesmo que ocorre quando você põe açucar na panela e aquece, vira calda de pudim.
A glicose é o açucar mais simples, os organismos utilizam a dextrose diretamente no seu metabolismo, é fonte de energia instantanea, por isso entra na receita, para o esporo reagir e eclodir, depois o que leva ao crescimento é a fonte de amido, que o organismo metaboliza transformando também em glicose.

Prepare o meio, conte 20 minutos na pressão e desligue o fogo. Deixe a pressão na válvula baixar, abra a panela próximo a glove e leve o frasco para dentro dela, derrame nas placas, cubra com a tampa ou filme, espere endurecer, inocule, feche e guarde de cabeça pra baixo. Não deixe pingar água no agar que estraga tudo.

Outra opção é esterilizar no microondas, é muito mais fácil, prático, rápido, confiavel, faz direto nas placas.

Putz... pode ser q eu esteja fazendo tudo errado entao... especialmente porque eu sempre deixei a agua condensada cair no agar e nunca pus as petri de cabeca pra baixo... e alem disso sempre deixei o dobro de tempo pra estereliza e se a glicose é um fator importante pra germinar o esporo deve ser isso porque só 3 das 19 placas germinaram ((. Que desaaaanimo q da, isolamento é mais dificil do q eu pensava(dentro de termos CASEIROS claro)...

Sobre tirar a media da PP justo depois de diminuir a pressao pode ser quente demais pra manusear nao? sera q se eu espero 2 horas pra da uma esfriada vai da boró?

Nao to tendo muita sorte, mas emfim, agora eu tenho tanta media e placa petri aqui que nao vou desistir de tentar.

QUEST FOR THE LOST RIZOMORPHIC MYCELIUM!!! hehehe.

Sobre a esterelizacao de placas em microondas imagino q tenha conteudo espalhado pelo forum né? vou dar uma pesquizada, pode ser uma opcao bastante mais viavel...

Muito obrigado pelo supote dnv mauricio, eu to meio desanimado agora porque é minha segunda tentativa de isolamento mas nao vou desistir, acho q ainda da pra aproveita esses 2 pratos saudaveis né?

Abrx

 

[Mauricio]

Sobre tirar a media da PP justo depois de diminuir a pressao pode ser quente demais pra manusear nao? sera q se eu espero 2 horas pra da uma esfriada vai da boró?

Use luva para forno

 

[Paje]

Salve
entao man não esuqeça d edeixar a pp esfriar 100% poiis se abrir ela quente o ar quente dela sai e entra o ar de fora que esta frio podendo levar contaminantes para suas placas.
Esquece este lance de cremogema..... oque voce pode usar que tem mais nutrientes é CDA ao inves de BDA.
Aproveita o esporo e faz CL tambem pois assim vai saber se o esporo esta germinando bem e fulturamente pode usar a CL para inocular as placas e ter uma resposta bem mais rapida...
paz