Ou Esterilização fracionada. Consiste no aquecimento repetido com intervalo adequado. O calor úmido à temperatura de 100°C é insuficiente para a Esterilização, pois não é capaz de destruir os Esporos. Repetindo-se o aquecimento 2 ou 3 dias consecutivos, com períodos de resfriamento entre eles, consegue-se destruir todas as Bactérias. No primeiro aquecimento destrói-se apenas as formas vegetativas, não destruindo os Esporos. No segundo aquecimento há morte das formas vegetativas dos Esporos poupados no primeiro aquecimento. No terceiro aquecimento há morte de formas vegetativas que ainda sobreviveram após o segundo aquecimento.

Este processo é freqüentemente usado para Esterilização de certos meios de cultura que se alteram à temperatura elevadas, ou quando não há meios para fazer outro tipo de Esterilização.