Autoclave, esterilização por calor seco - Forno de pasteur (MUFLA), Ester. meio de cultura celular

ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS PARA A CULTURA DE CÉLULAS​

Professor: SÃO MIGUEL DO OESTE 2009​

INTRODUÇÃO​

Esterilização é um termo absoluto, que implica na inativação total de todos os microrganismos quanto à capacidade reprodutiva, mas que não significa, necessariamente a destruição de todas suas enzimas, de seus produtos metabólicos, toxinas, etc. (MOURA, 1999).

A esterilização pode ser obtida através da aplicação do calor úmido ou seco, da irradiação com raios gama ou X, de certos compostos químicos em solução ou em vapor e da filtração. A esterilização pelo calor úmido envolve a desnaturação proteica, a coagulação de proteínas e de enzimas, bem como a fusão de lipídeos da membrana celular. Pelo calor seco a morte é principalmente um processo de oxidação, havendo necessidade do emprego de temperaturas mais elevadas (MOURA, 1999).

É muito importante ter a certeza que a esterilização realmente ocorreu. Os esterilizadores funcionam apropriadamente de acordo com as regras do fabricante. No uso clinico, algumas variantes podem reduzir a efetividade do processo de esterilização, incluindo o empacotamento do material e carga inadequados, assim como o baixo volume de água nas autoclaves, resultando em leituras normais de temperatura, porém sem esterilização adequada (NISENGARD, 1997).

AUTOCLAVE​

O emprego de calor úmido sob pressão é o processo mais usado em esterilização e deve ser o método de escolha, desde que possível (MOURA, 1999). É um sistema fechado no qual o vapor de água sob aumento de pressão fornece temperaturas elevadas que permitem a esterilização semelhante a uma grande panela de pressão. Uma câmara com força suficiente para suportar pressões de 20 até 30 libras por cm² e, eventualmente, suportar também alto vácuo (MOURA, 1999).

O funcionamento da autoclave é levada com um vapor fluente afim de remover todo o ar contaminado existente no seu interior. A temperatura elevada, e não a pressão, é que promove a morte dos micro-organismos, quanto maior é a pressão no interior da autoclave, maior é a temperatura, sendo a temperatura de 121 °C por 15 minutos e sua pressão em torno de 15 psi. O tempo necessário para esterilização por esse método depende do tipo de material que será autoclavado, e depende também do volume do material (PERES, 2005).

Há uma relação entre a temperatura empregada e o tempo necessário para a esterilização. Quanto maior a temperatura, menor o tempo necessário.

A totalidade do material a ser esterilizado deve entrar em contato com o vapor saturado, na temperatura adequada e durante o tempo suficiente (MOURA, 1999).

Um fator de grande importância na exaustão completa do ar da autoclave é que geralmente as temperaturas de autoclavação são medidas por manômetros de pressão, em função das relações conhecidas e não diretamente por termômetros. A remoção do ar é dificultada se os materiais estiverem embrulhados ou encerrados em caixas. Para contornar essa dificuldade, especialmente para a esterilização de roupas de cirurgia, foi introduzida a aplicação de vácuo antes da admissão de vapor, na autoclave. Soluções, meios de cultura que não contem materiais termo sensíveis e contaminados são esterilizados freqüentemente neste aparelho. O calor leva mais tempo para penetrar em um material viscoso ou sólido do que em material fluido. Esse método de esterilização é ineficiente para micro-organismos em materiais impermeáveis ao vapor (PERES, 2005).

Os materiais geralmente autoclavados são pipetas de vidro, béqueres e também algumas garrafas e meios de culturas resistentes a temperaturas de 180 °C (garrafas quando são autoclavadas devem ter suas tampas levemente abertas), ponteiras e micropipetas, água, plásticos que podem autoclavados, meios de cultura para bactérias, solução salina tamponada com sais de fosfato e outros líquidos. Para verificar-se se a autoclave esta sendo eficiente à esterilização, o indicador biológico é freqüentemente autoclavado com o material, este indicar consiste em tubo de cultura que contem uma ampola com meio estéril e uma fita de papel coberta de esporos, depois de autoclavada a ampola é quebrada em fluxo laminar e a cultura incubada por vários dias, se a bactéria não crescer no meio a esterilização foi realizada com sucesso. (PERES, 2005).

Existem vários modelos de autoclaves, mas podemos dividi-los em duas classes principais:

Autoclave de paredes simples: Este tipo de autoclave pode existir em variadíssimos tamanhos, sendo geralmente formado por um cilindro metálico resistente, vertical ou horizontal e com uma tampa que permite fechar hermeticamente o autoclave.

Para que a esterilização seja bem feita, é necessário ter em atenção que no início do aquecimento existe ar no interior do autoclave além do vapor de água, sendo por isso necessário abrir a válvula para deixar sair o ar. Quando termina o tempo calculado para uma correcta esterilização, deve-se retirar a chama e deixar arrefecer lentamente, só abrindo a torneira de descarga e lentamente, após o manômetro indicar zero. Deve-se ter o máximo de cuidado ao abrir devido à pressão interna, abrindo-se a válvula de escape de pressão somente pelo lado contrário da tampa autoclave. A temperatura do processo a vapor varia conforme os materiais a serem esterilizados e situa-se entre 121 °C e 134 °C. (http://pt.wikipedia.org/wiki/Autoclave).

Autoclave de paredes duplas: Este tipo de autoclave possui duas câmaras sendo uma interna e outra externa. O espaço entre a câmara interna de pressão e a externa é utilizado para manutenção e controle da temperatura durante o processo. Também conhecido como autoclave horizontal, o modelo possui bomba de vácuo para a retirada do ar antes da entrada do vapor e para secagem dos materiais no final do processo. A retirada do ar e entrada do vapor é feita em pulsos de forma a uniformizar a temperatura e acção do vapor esterilizante em toda a câmara de processo (interna).

Neste modelo, o vapor é gerado em caldeira separada abastecida de água destilada ou purificada com filtros de osmose reversa. As etapas do ciclo são gravadas digitalmente e impressas , garantindo a segurança e certificando a operação. Cada país possui um conjunto de normas exigindo estas certificações de qualidade no processo de esterilização para hospitais, laboratórios ou indústrias. (Autoclave – Wikipédia, a enciclopédia livre).

ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO: FORNO DE PASTEUR (MUFLA)​

Mufla é uma tipo de estufa para altas temperaturas usada em laboratórios, principalmente de química. Consiste basicamente de uma câmara metálica com revestimento interno feito de material refratário e equipada com resistências capazes de elevar a temperatura interior a valores acima de 1000 ºC. (MOURA, 1999).

A ação letal resulta do ar que o circunda. É fundamental que a totalidade do material permita penetração do calor. Devido a restrições, o forno de Pasteur tem um número restrito de aplicações.(Kit.net) .

O emprego está limitado a esterilização daqueles objetos que não podem resistir a ação corrosiva do vapor ou a situações que o contato direto com o vapor saturado, em toda superfície do mesmo, não é prática ou inatingível. O forno de Pasteur tem restrição a esterilização de óleos, de alguns pós, de instrumentos cirúrgicos de vidrarias. Não serve para esterilizar algodão, lã, plásticos, nem pode ser usado quando houver presença de água nem produto, mesmo que seja água de cristalização. (MOURA, 1999).

Condições padrões de esterilização: 170 °C durante 90 minutos ou 160 °C por 120 minutos. Acima de 180 °C não são recomendadas pela possibilidade de causar alterações nas ligas metálicas, principalmente nos pontos de solda. (Kit.net)

O tempo de 30 minutos quando se utiliza os meios químicos, promove apenas a desinfecção do material e/ou instrumental e não a sua esterilização. (http://www.angelfire.com/nm/cirurgia/esterili.html)

O calor seco provoca oxidação dos constituintes orgânicos das células; onde o calor seco exige temperatura e tempo de exposição muito elevadas, ao contrario do calor úmido, que sua propagação de calor é mais rápida. Normalmente o calor seco é somente aplicado em casos de materiais impermeáveis ou danificado pela umidade, como óleos, vidrarias, instrumentos cortantes e metais (PERES, 2005).

ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA CELULAR​

Quando se trabalha com cultura de células é necessário que haja um ambiente estéril isso porque as células são cultivadas em meios ricos em nutrientes onde há grande possibilidade de ocorrer a propagação de microrganismos contaminantes é alta. O local reservado a cultura de células, a conduta durante a execução dos experimentos é fundamental para a manutenção do ambiente, incluindo a limpeza do material e objetos utilizados. Esterilização é a destruição de todas as formas de vida microbianas, bacterianas, fungos e esporos, então um objeto estéril esta totalmente livre de micro-organismos viáveis e outros agentes infectantes. Os agentes físicos empregados normalmente para a esterilização desses objetos são autoclavação, radiação ultravioleta, radiação ionizante e filtração( PERES, 2005).

Filtração é utilizada na descontaminação do ar com o ambiente e de líquidos que apresentam componentes termossensíveis, que não podem ser esterilizados por autoclavação, e não há morte de microrganismos. O processo de filtração consiste pela passagem de liquido ou gás por material com pequenos poros que impedem a passagem de microrganismos. Há dois tipos de filtros: os reutilizáveis que podem ser esterilizados por autoclavação, e filtros descartáveis e pré-esterilizados a filtração é mais rápida e os erros são menores. (PERES, 2005).

REFERENCIAS​

PERES, Carmem Maldonado; CURI, Rui; Como Cultivar Células. 1ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005

MOURA, Roberto A. de Almeida. Técnicas de laboratório. 3. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 1999. 511 p. ISBN 8573791136

NISENGARD, Russell J.; NEWMAN, Michael G.. Microbiologia oral e imunologia. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1997. 395 p. ISBN 8527704005