Boa noite a todos.
Por mais de 3 anos este relato foi sonegado, na verdade até havia esquecido porque já estou afastado dos cultivos ah algum tempo e fazendo uma limpeza no computador aqui vi fotos deste processo e achei que antes de deletar as fotos, já passou da hora de apresentar essa técnica caseira que eu desenvolvi após ficar frustrado com várias contaminações usando as técnicas tradicionais de seringa multiesporos (pote de coleta, etc). Além de usar materiais 100% estéreis o foco foi principalmente tornar a exposição de materiais (carimbo, agua e suspensão de esporos) ao ar a mínima possível, mesmo dentro da glove box.
A idéia é simples: porque extrair a água da ampola de agua estéril para misturar num pote com os esporos e depois voltar a seringa se eu posso simplesmente jogar os esporos diretamente na ampola e voltar a lacrá-la, transformando-a numa ampola de esporos? Desse modo eu exponho muito menos a agua ao ar, diminuindo riscos de contaminação. O fato da água da ampola ser água estéril (destilada/deionizada), sem minerais/nutrientes, faz com que os esporos não germinem necessariamente, mas fiquem num estado de anabiose/hibernação e neste estado dura meses em geladeira (não freezer).
Além disso com esta tecnica é possivel pegar uma quantidade mínima de esporos, talvez menor que um centésimo do carimbo, sem nem precisar abrir o carimbo completamente, preservando assim o carimbo e tendo uma suspensão bem diluida de esporos, mas totalmente eficaz para inoculação.
Por motivos didáticos tem fotos do processo feito em 2012 com Brasil e outras strains (no qual é feito fora de glove box, mas que mostra o processo de fazer as ampolas) misturadas com fotos de 2013 onde as ampolas já prontas são inoculadas em milho , feito o casing e frutificados (porque não registrei fotos da manufatura das ampolas dentro da glove box).
Materiais:
Carimbo: Campinas (obtido via FSRE - 02/2011) - alguns carimbos da strain Brasil, mas não tirei registros depois.
Ampolas de 10mL de água estéril para injeção
Glove box (opcional)
Material para inoculação (milho, PF tek, etc) - no caso milho.
Aplicador de cola quente com refil (bastão)
Seringas estéreis com agulhas lacradas direto da farmácia
Pote com tampa para guardar as ampolas na geladeira
Arame de ferro galvanizado BEM FINO (não pode ser aluminio - teste com um ímã) - vendido em lojas de materiais para artesanato
Base para amarrar o arame de ferro (eu usei uma peça de cerâmica qualquer)
Alicate pequeno de bico fino
Fonte de calor para flambar o arame (no início como vão ver pelas imagens foi usado um pote com alcool, depois utilizei um mini-maçarico, que se mostrou muito mais eficaz, inclusive podendo ser usado dentro da glove box)
Procedimento:
O primeiro passo é fazer o raspador de esporos com um pedaço do arame fino de ferro galvanizado (uns 20 cm), primeiro fazendo um laço bem pequeno em uma ponta (se necessário usar alicate de bico fino para fazer o laço) e amarrando a outra ponta numa base para que o arame possa ficar em repouso na vertical. Para ver a dimensão do laço tem uma foto mostrando meu dedo segurando, que serve como referencial. Nesse laço ficarão os esporos que serão transferidos para a ampola.
As ampolas de água tem a etiqueta removida e são limpas com alcool 70° (ou lysol).
Liga-se o aplicador de cola quente na tomada com o refil (bastão) e deixa-se esquentando...
Pega-se o arame pela base e se flamba na chama. A primeira vez foi feita usando simplesmente um pote com alcool queimando para flambar
Mais tarde comecei a utilizar mini-maçaricos de bolso, desses que se acha em qualquer tabacaria, que flambam muito mais rápido e são mais seguros, inclusive podendo ser usados dentro de glove box. Após a flambagem, a base com o arame é deixado resfriando e um recipiente é posto em cima desse conjunto para isolar do ar vizinho; obviamente você não vai raspar o carimbo usando o arame quente e arriscando torrar os esporos portanto neste passo do resfriamento eu vi a importância de se usar um arame bem fino, pois pela sua menor massa, possui portanto baixa capacidade térmica, o que em outras palavras quer dizer que o arame vai se resfriar muito mais rapido.
Enquanto o arame esfria (o que não demora mais de 2-3 minutos) se pega a embalagem do carimbo e a limpa com cuidado por fora com algodão embebido em alcool ou lysol (e claro, com as mãos sempre limpas, mesmo com luvas). Então se abre o carimbo parcialmente até ver os esporos e se raspa com o laço do arame até acumular uma pequena quantidade de esporos no laço, daí volta-se a fechar o carimbo. Pode-se usar uma base rígida e limpa embaixo do carimbo para auxiliar na raspagem e evitar de rasgar/perfurar o carimbo. Evite pegar no arame muito próximo do laço, mesmo com a mão 'limpa', pois essa parte imergirá depois na agua da ampola.
Rapidamente abre-se uma ampola de água e pega-se esta ponta do laço e sacode com cuidado dentro da mesma, batendo com o laço na parede interna para os esporos se soltarem na agua e tomando cuidado para não afundar o arame muito na água (porque você provavelmente pegou nas partes do arame mais próximas da base).
A essa altura a cola quente deve estar bem quente mesmo e já saindo sozinha pelo bico do aplicador, bem fluida. Pelo que li em uma referência na época que fiz estes experimentos a temperatura do aplicador pode ser acima de 130°C, o que é suficiente para matar qualquer microorganismo "comum" que esteja ali. Dai você põe o bico do aplicador dentro do bico da ampola e joga a cola lá (deve estar bem quente, tanto para manter as condições da ampola estéreis como também ter maior aderência à mesma). Como a cola está muito quente, ela vai aquecer e expandir o pequeno volume de ar que tem ali na ampola e isso vai gerar algumas bolhas na cola. Depois que você passou o primeiro lacre de cola quente e deixou esfriar você passa mais cola por cima e nas laterais próximas. Depois de tudo você dá umas apertadas leves na ampola para ver se está vazando. Se tiver feito do jeito certo, não vazará nada. Dê uma sacudida para espalhar bem os esporos e anote na ampola a strain e a data de fabricação, para saber a quanto tempo está hidratando, se quiser anote também a data do carimbo do qual foi feita a ampola. Por limpar com álcool a superfície externa das ampolas na hora do uso eu descobri na prática que é melhor usar um rótulo ao invés de escrever por cima (pois o alcool pode dissolver a tinta) e alem disso você ainda pode envolver/embrulhar a ampola com papel aluminio e anotar no papel aluminio estas informações.
Ponha a(s) ampola(s) prontas dentro de um pote devidamente fechado e guarde na parte baixa da geladeira, para não congelar
Abaixo um esquema bem melhor adotado depois com uma glovebox de papelão com papel aluminio e filme plastico que eu fiz depois e utilizando um micro maçarico (que veio a estragar depois).. IMPORTANTE: se for usado glovebox, jamais utilize álcool dentro da mesma para assepsia pois neste método você utilizará o maçarico e isto pode provocar um acidente sério.
Por mais de 3 anos este relato foi sonegado, na verdade até havia esquecido porque já estou afastado dos cultivos ah algum tempo e fazendo uma limpeza no computador aqui vi fotos deste processo e achei que antes de deletar as fotos, já passou da hora de apresentar essa técnica caseira que eu desenvolvi após ficar frustrado com várias contaminações usando as técnicas tradicionais de seringa multiesporos (pote de coleta, etc). Além de usar materiais 100% estéreis o foco foi principalmente tornar a exposição de materiais (carimbo, agua e suspensão de esporos) ao ar a mínima possível, mesmo dentro da glove box.
A idéia é simples: porque extrair a água da ampola de agua estéril para misturar num pote com os esporos e depois voltar a seringa se eu posso simplesmente jogar os esporos diretamente na ampola e voltar a lacrá-la, transformando-a numa ampola de esporos? Desse modo eu exponho muito menos a agua ao ar, diminuindo riscos de contaminação. O fato da água da ampola ser água estéril (destilada/deionizada), sem minerais/nutrientes, faz com que os esporos não germinem necessariamente, mas fiquem num estado de anabiose/hibernação e neste estado dura meses em geladeira (não freezer).
Além disso com esta tecnica é possivel pegar uma quantidade mínima de esporos, talvez menor que um centésimo do carimbo, sem nem precisar abrir o carimbo completamente, preservando assim o carimbo e tendo uma suspensão bem diluida de esporos, mas totalmente eficaz para inoculação.
Por motivos didáticos tem fotos do processo feito em 2012 com Brasil e outras strains (no qual é feito fora de glove box, mas que mostra o processo de fazer as ampolas) misturadas com fotos de 2013 onde as ampolas já prontas são inoculadas em milho , feito o casing e frutificados (porque não registrei fotos da manufatura das ampolas dentro da glove box).
Materiais:
Carimbo: Campinas (obtido via FSRE - 02/2011) - alguns carimbos da strain Brasil, mas não tirei registros depois.
Ampolas de 10mL de água estéril para injeção
Glove box (opcional)
Material para inoculação (milho, PF tek, etc) - no caso milho.
Aplicador de cola quente com refil (bastão)
Seringas estéreis com agulhas lacradas direto da farmácia
Pote com tampa para guardar as ampolas na geladeira
Arame de ferro galvanizado BEM FINO (não pode ser aluminio - teste com um ímã) - vendido em lojas de materiais para artesanato
Base para amarrar o arame de ferro (eu usei uma peça de cerâmica qualquer)
Alicate pequeno de bico fino
Fonte de calor para flambar o arame (no início como vão ver pelas imagens foi usado um pote com alcool, depois utilizei um mini-maçarico, que se mostrou muito mais eficaz, inclusive podendo ser usado dentro da glove box)
Procedimento:
O primeiro passo é fazer o raspador de esporos com um pedaço do arame fino de ferro galvanizado (uns 20 cm), primeiro fazendo um laço bem pequeno em uma ponta (se necessário usar alicate de bico fino para fazer o laço) e amarrando a outra ponta numa base para que o arame possa ficar em repouso na vertical. Para ver a dimensão do laço tem uma foto mostrando meu dedo segurando, que serve como referencial. Nesse laço ficarão os esporos que serão transferidos para a ampola.
As ampolas de água tem a etiqueta removida e são limpas com alcool 70° (ou lysol).
Liga-se o aplicador de cola quente na tomada com o refil (bastão) e deixa-se esquentando...
Pega-se o arame pela base e se flamba na chama. A primeira vez foi feita usando simplesmente um pote com alcool queimando para flambar
Mais tarde comecei a utilizar mini-maçaricos de bolso, desses que se acha em qualquer tabacaria, que flambam muito mais rápido e são mais seguros, inclusive podendo ser usados dentro de glove box. Após a flambagem, a base com o arame é deixado resfriando e um recipiente é posto em cima desse conjunto para isolar do ar vizinho; obviamente você não vai raspar o carimbo usando o arame quente e arriscando torrar os esporos portanto neste passo do resfriamento eu vi a importância de se usar um arame bem fino, pois pela sua menor massa, possui portanto baixa capacidade térmica, o que em outras palavras quer dizer que o arame vai se resfriar muito mais rapido.
Enquanto o arame esfria (o que não demora mais de 2-3 minutos) se pega a embalagem do carimbo e a limpa com cuidado por fora com algodão embebido em alcool ou lysol (e claro, com as mãos sempre limpas, mesmo com luvas). Então se abre o carimbo parcialmente até ver os esporos e se raspa com o laço do arame até acumular uma pequena quantidade de esporos no laço, daí volta-se a fechar o carimbo. Pode-se usar uma base rígida e limpa embaixo do carimbo para auxiliar na raspagem e evitar de rasgar/perfurar o carimbo. Evite pegar no arame muito próximo do laço, mesmo com a mão 'limpa', pois essa parte imergirá depois na agua da ampola.
Rapidamente abre-se uma ampola de água e pega-se esta ponta do laço e sacode com cuidado dentro da mesma, batendo com o laço na parede interna para os esporos se soltarem na agua e tomando cuidado para não afundar o arame muito na água (porque você provavelmente pegou nas partes do arame mais próximas da base).
A essa altura a cola quente deve estar bem quente mesmo e já saindo sozinha pelo bico do aplicador, bem fluida. Pelo que li em uma referência na época que fiz estes experimentos a temperatura do aplicador pode ser acima de 130°C, o que é suficiente para matar qualquer microorganismo "comum" que esteja ali. Dai você põe o bico do aplicador dentro do bico da ampola e joga a cola lá (deve estar bem quente, tanto para manter as condições da ampola estéreis como também ter maior aderência à mesma). Como a cola está muito quente, ela vai aquecer e expandir o pequeno volume de ar que tem ali na ampola e isso vai gerar algumas bolhas na cola. Depois que você passou o primeiro lacre de cola quente e deixou esfriar você passa mais cola por cima e nas laterais próximas. Depois de tudo você dá umas apertadas leves na ampola para ver se está vazando. Se tiver feito do jeito certo, não vazará nada. Dê uma sacudida para espalhar bem os esporos e anote na ampola a strain e a data de fabricação, para saber a quanto tempo está hidratando, se quiser anote também a data do carimbo do qual foi feita a ampola. Por limpar com álcool a superfície externa das ampolas na hora do uso eu descobri na prática que é melhor usar um rótulo ao invés de escrever por cima (pois o alcool pode dissolver a tinta) e alem disso você ainda pode envolver/embrulhar a ampola com papel aluminio e anotar no papel aluminio estas informações.
Ponha a(s) ampola(s) prontas dentro de um pote devidamente fechado e guarde na parte baixa da geladeira, para não congelar
Abaixo um esquema bem melhor adotado depois com uma glovebox de papelão com papel aluminio e filme plastico que eu fiz depois e utilizando um micro maçarico (que veio a estragar depois).. IMPORTANTE: se for usado glovebox, jamais utilize álcool dentro da mesma para assepsia pois neste método você utilizará o maçarico e isto pode provocar um acidente sério.
