- 02/05/2008
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Muito bem ...
Humildemente venho apresentar a tecnica que farei futuramente quando tiver mais tempo para os vermelitos.
Resumindo tudo abaixo: Amanitas necessitam de micorrizaçao em Pinus, como certos trabalhos descrevem. Então pesquisei e fiz modificaçoes em um trabalho sobre micorrizas, que acondiciona as sementes estereis no meio de plantio + substrato colonizado. segue abaixo:
1. Produção do inóculo fúngico:
Para a produção do inóculo fúngico a ser usado na inoculação das plantas, culturas em meio MNM, com 20 dias de idade serão utilizadas para obtenção de discos de meio (8 mm de diâmetro) contendo micélio a partir da extremidade das colonias. Os discos de micélio serão colocados em 25 mL de MNM líquido em frascos tipo erlenmeyer, de 250 mL de capacidade, seguindo-se de
incubação a 25 ± 1 ºC durante 20 dias em incubadora B.O.D. Após esse período, o micélio produzido será fragmentado em liquidificador esterilizado durante 5 s a 3600 rpm, sob condições assépticas de fluxo laminar, e a
suspensão miceliana assim obtida será utilizada para inocular 300 mL de substrato sólido constituído de uma mistura de turfa, vermiculita, na proporção de 1:4 (V:V), e
200 mL de meio MNM líquido, em frascos tipo conserva de 900 mL. Essa mistura será previamente submetida a dois ciclos de esterilização em autoclave a 121ºC. O primeiro durante 60 min, antes da adição do meio de cultura, e o segundo durante 20 min, após a adição de meio.
Os frascos serão mantidos em B.O.D. a 25 ± 1 ºC, na ausência de luz, durante cerca de 2 meses, até que toda a parte visível do substrato apresente colonização miceliana.
2.Preparo do substrato de plantio
O substrato de plantio, constituído por turfa e vermiculita, na proporção de 1:3(V:V), será previamente esterilizado em autoclave a 121 ºC por 60 min. A esse
substrato adicionará uma solução nutritiva contendo os seguintes elementos (mg por planta): K, 16; Mn, 0,15; Mg, 3; Zn, 0,0375; Cu, 0,125; Mo, 0,05; B, 0,05; e Fe,
0,375 (BOUGHER et al., 1990). A fonte de nitrogênio, nitrato de amônia (NH4NO3),será aplicada em 5 parcelas ao longo do experimento, de modo a obter 35 mg por
planta, tendo a primeira sido aplicada aos 15 dias após o plantio. O fósforo (P) foi adicionado na forma de Ca(H2PO4)2H2O e administrado em solução na dose de 0,5 mg de P por planta.
3.Germinação das sementes
As sementes de Pinus spp., fornecidos pela empresa XXX serão desinfetadas em álcool 70 % por 1 minuto, lavadas em água destilada eesterilizada por três vezes consecutivas, e então transferidas para uma solução de
germinação de ácido bórico (3 μM), glicose (2 g.L-1) e sulfato de cálcio (500 μM), esterilizada, com pH 5,7. Esses procedimentos serão feitos sob condições assépticas de capela de fluxo laminar. As sementes serão deixadas nessa solução durante 3 dias, à temperatura ambiente, sob agitação constante.
4.Inoculação e condução do experimento
Após 2 meses de crescimento o inóculo fúngico (micélio + substrato sólido) será retirado dos frascos e lavado com água destilada estéril. Em seguida, o inóculo será adicionado ao substrato de plantio. A inoculação será feita antes da semeadura, adicionando-se 10 % do
inoculante, ao substrato de plantio, totalizando 6 mL
por tubete. Será feita uma homogeneização manual do inoculante sob condições assépticas. Em seguida, o substrato foi umedecido com água destilada
esterilizada. Após a inoculação e o plantio, as plantas serão mantidas em estufa e regadas diariamente com água destilada esterilizada. Após uma semana, será feito o desbaste deixando-se apenas uma planta por tubete.
O aparecimento do micélio é um misterio nesta parte do trabaho.
Humildemente venho apresentar a tecnica que farei futuramente quando tiver mais tempo para os vermelitos.
Resumindo tudo abaixo: Amanitas necessitam de micorrizaçao em Pinus, como certos trabalhos descrevem. Então pesquisei e fiz modificaçoes em um trabalho sobre micorrizas, que acondiciona as sementes estereis no meio de plantio + substrato colonizado. segue abaixo:
1. Produção do inóculo fúngico:
Para a produção do inóculo fúngico a ser usado na inoculação das plantas, culturas em meio MNM, com 20 dias de idade serão utilizadas para obtenção de discos de meio (8 mm de diâmetro) contendo micélio a partir da extremidade das colonias. Os discos de micélio serão colocados em 25 mL de MNM líquido em frascos tipo erlenmeyer, de 250 mL de capacidade, seguindo-se de
incubação a 25 ± 1 ºC durante 20 dias em incubadora B.O.D. Após esse período, o micélio produzido será fragmentado em liquidificador esterilizado durante 5 s a 3600 rpm, sob condições assépticas de fluxo laminar, e a
suspensão miceliana assim obtida será utilizada para inocular 300 mL de substrato sólido constituído de uma mistura de turfa, vermiculita, na proporção de 1:4 (V:V), e
200 mL de meio MNM líquido, em frascos tipo conserva de 900 mL. Essa mistura será previamente submetida a dois ciclos de esterilização em autoclave a 121ºC. O primeiro durante 60 min, antes da adição do meio de cultura, e o segundo durante 20 min, após a adição de meio.
Os frascos serão mantidos em B.O.D. a 25 ± 1 ºC, na ausência de luz, durante cerca de 2 meses, até que toda a parte visível do substrato apresente colonização miceliana.
2.Preparo do substrato de plantio
O substrato de plantio, constituído por turfa e vermiculita, na proporção de 1:3(V:V), será previamente esterilizado em autoclave a 121 ºC por 60 min. A esse
substrato adicionará uma solução nutritiva contendo os seguintes elementos (mg por planta): K, 16; Mn, 0,15; Mg, 3; Zn, 0,0375; Cu, 0,125; Mo, 0,05; B, 0,05; e Fe,
0,375 (BOUGHER et al., 1990). A fonte de nitrogênio, nitrato de amônia (NH4NO3),será aplicada em 5 parcelas ao longo do experimento, de modo a obter 35 mg por
planta, tendo a primeira sido aplicada aos 15 dias após o plantio. O fósforo (P) foi adicionado na forma de Ca(H2PO4)2H2O e administrado em solução na dose de 0,5 mg de P por planta.
3.Germinação das sementes
As sementes de Pinus spp., fornecidos pela empresa XXX serão desinfetadas em álcool 70 % por 1 minuto, lavadas em água destilada eesterilizada por três vezes consecutivas, e então transferidas para uma solução de
germinação de ácido bórico (3 μM), glicose (2 g.L-1) e sulfato de cálcio (500 μM), esterilizada, com pH 5,7. Esses procedimentos serão feitos sob condições assépticas de capela de fluxo laminar. As sementes serão deixadas nessa solução durante 3 dias, à temperatura ambiente, sob agitação constante.
4.Inoculação e condução do experimento
Após 2 meses de crescimento o inóculo fúngico (micélio + substrato sólido) será retirado dos frascos e lavado com água destilada estéril. Em seguida, o inóculo será adicionado ao substrato de plantio. A inoculação será feita antes da semeadura, adicionando-se 10 % do
inoculante, ao substrato de plantio, totalizando 6 mL
por tubete. Será feita uma homogeneização manual do inoculante sob condições assépticas. Em seguida, o substrato foi umedecido com água destilada
esterilizada. Após a inoculação e o plantio, as plantas serão mantidas em estufa e regadas diariamente com água destilada esterilizada. Após uma semana, será feito o desbaste deixando-se apenas uma planta por tubete.
O aparecimento do micélio é um misterio nesta parte do trabaho.
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