- 25/02/2017
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Salvem meus queridos, Rafael aqui, peguei emprestado essa conta aqui de um camarada porque perdi minha conta antiga e não consigo criar uma conta nova no fórum, pois não recebo o e-mail de confirmação.
Dito isso, venho aqui contar como foi o processo de criação da strain Gepetto, que tem feito sucesso por causa da produtividade, potência e facilidade no cultivo, além de serem cogumelos com aparência bem exótica (chapéu claro com esporos roxos), algo que eu nunca tinha visto antes (se bem que depois do Gepetto milagrosamente surgiram outras strains idênticas, claras com esporos roxos rs...)
Resolvi postar aqui pois já vi meia dúzia de cultivadores e vendedores mudando o nome da minha strain, renomeando, dizendo que é isolado de fulano, que ciclano trouxe de sei lá onde... Aquele mesmo papo de sempre né? Anos e mais anos nesse mundo de cultivadores e nada muda
Enfim, achei importante descrever aqui a história da strain (e das outras que vieram a partir dele) para que a história não se perca com o tempo, e aproveitar para ensinar o processo de cruzamento entre strains de cogumelos da espécie Psilocybe cubensis. Assim, mais gente consegue fazer também. Espero que gostem...
Nos últimos anos tenho realizado muitos cruzamentos entre strains de diversas espécies de cogumelos, tanto comestíveis quanto cubensis, tudo feito em laboratório profissional, com a técnica correta descrita na literatura científica, nada de bro science, improviso ou "técnica alternativa que ouvi dizer por aí". Depois de centenas de cruzamentos e muita prática, venho dar algumas dicas.
1) É MUITO custoso cruzar strains $$$ vai muito material, são centenas de placas de Petri, muito meio de cultura, muita organização pra não se perder, equipamentos corretos etc...
Nenhum cultivo ou criação no mundo, do pé de alface à criação de gado, o criador irá passar pra frente uma genética fraca, ruim, pouco produtiva, doente. Com cogumelo não seria diferente. Para cruzar strains não basta botar 1 colônia haploide da strain A com outra colônia da strain B numa placa e pronto. É preciso fazer dezenas de cruzamentos entre essas strains, realizar o cultivo de cada um desses cruzamentos e SÓ AÍ decidir qual foi o melhor cruzamento entre a strain AxB, aquele indivíduo que você irá manter e passar pra frente, as outras são todas descartadas. A ideia é ter cada vez um cultivo melhor, não pior. Pense nisso na hora de passar ou adquirir uma cultura de alguém. Temos cães lindos de raça hoje em dia porque os criadores no passado escolheram sempre os melhores indivíduos, as melhores matrizes... Foco na genética bonita e produtiva, irmão. Nem toda mutação torta feia com baixa produtividade é uma coisa que deve ser levada adiante. Se fossem cães com defeito, certamente seriam sacrificados pra nem dar chance de reproduzir. Pense nisso quando for sua vez de cruzar strains.
Tendo isso em mente, saiba que apenas 25% das tentativas de cruzamento irão, de fato, cruzar. Cubensis é bifatorial heterotálico, lembre-se disso. 75% das placas vão para o lixo, por isso que eu uso placa tripartida pra cruzamentos e a placa de 60mm pra armazenamento dos monocárions. Dessas 25% que sobram, duas ou três strains valem a pena, o resto também é lixo. Dessas três, provavelmente uma será diferente dos parentais, as outras 2 precisará ir para a geração seguinte (F2) pra expressar os genes recessivos e talvez ter um fenótipo diferenciado. Então assim, não espere ter uma strain PICA em um semestre, porque não vai. É um trabalho de anos pra ter uma strain decente e que seja produtiva, de qualidade.
2) É FUNDAMENTAL usar a técnica correta, qualquer "tecnica alternativa" aumenta muito suas chances de estar cometendo um erro.
O erro mais comum que vejo por aí em grupos e fóruns é gente usando técnica alternativa pra cruzar strains, achando que conseguiram um monocarion isolado quando na verdade são vários monocarions juntos e a pessoa não percebe justamente pq isola "no olho", apenas observando o micélio, afinal ela não fez diluição seriada e teve que separar as colônias visualmente. Aí na hora de cruzar, as 2 colônias supostamente haploides eram na verdade várias colônias haploides erroneamente isoladas.
Aí o cara "cruza", ve o micélio rizomórfico na placa e acredita que cruzou strain A com B. Talvez nem tenha ocorrido AxB, mas sim AxA ou BxB, tendo em vista que se vc não faz diluição seriada, os esporos se comportam como cachos de uva, nunca a strain A vai cruzar com a B usando técnicas alternativas, sem quebrar tensão superficial da água com surfactante e posteriormente diluição seriada, vão acabar cruzando AxA ou BxB antes mesmo de ter uma AxB). Enfim, já vi de tudo, até gente que bota esporos da strain A e da strain B num frasco, agita e inocula, depois supostamente "caça" os fenótipos dos cruzamentos. Quem faz isso certamente esqueceu as primeiras aulas de genética, quando a professora ensinou sobre as ervilhas de Mendel
Como que tu vai "caçar" o cruzamento sendo que na grande maioria das vezes o resultado é IGUALZINHO ao parental? kkkk é cada uma que parece duas rs... seguindo
A técnica correta é a diluição seriada dos esporos da strain A e da strain B, depois plaqueamento em MEA ou BDA, isolamento das colônias haplóides, confirmação da ausência de grampos de conexão no microscópio e posteriormente o cruzamento. O cruzamento deve ser feito em placa tripartida, seguindo tabela mais ou menos igual a essa:
Dependendo de quantos monocárions você possui de cada strain, e quantas strains você irá cruzar, são MILHARES de cruzamentos. Com a placa tripartida, você reduz os custos em 1/3 $
Alguns anos atrás resolvi cruzar TAT com RUST. Meu objetivo era um cogumelo branco igual o TAT mas com esporos alaranjados igual o RUST. Segue imagens dos parentais:
Pra começar a gente faz diluição seriada da strain A e da strain B
Para isso é necessário esterilizar ponteiras, pipeta e todos os materiais usados, além de claro, água destilada em tubos falcon com 9 ml de água com surfactante (eu usei tween 80). Em seguida é só fazer uma solução concentrada de esporos A e outra B e proceder com a diluição seriada. Quem quiser mais detalhes de como fazer, procure um PDF do André, da UNESP de rio claro sobre diluição seriada. Tem no google, é só adaptar.
Pegamos 1 ml dessa solução ultra concentrada de esporos e passamos para o tubo falcon seguinte, que possui 9ml de água destilada esteril com surfactante. Ou seja, diluimos 10x nossa solução (10-¹). Descartamos a ponteira da pipeta, agitamos o falcon em agitador vortex por 1 minuto, depois procedemos com a próxima diluição. Colocamos ponteira nova na pipeta, pipetamos 1 ml dessa solução 10-¹ e passamos para o tubo falcon seguinte, contento mais 9 ml. Agitamos no vortex e temos agora nossa solução 10-², e assim vamos até 10 a menos 6 talvez.
Ao final desse processo, você irá guardar os tubos falcon 10 a menos 4 até 10 a menos 6 da strain A e da strain B. Vai plaquear isso no meio de cultura usando 0,5 ml da solução com auxilio de uma alça de drigalski em dezenas de placas de petri de 90mm e vai incubar a 25´C.
Nessa primeira rodada você irá descobrir QUAL DILUIÇÃO resultou em uma melhor placa, ou seja, colônias DISTANTES ENTRE SI
Depois de descobrir qual tubo falcon resultou na placa mais agradável de se trabalhar os isolamentos, voltamos no tubo falcon e fazemos outras centenas de placas 90mm
O objetivo aqui é isolar o máximo de colônias haplóides possível em outras placas de 60mm, nomear cada uma (exemplo: TAT 1, TAT 2, TAT 3 etc.) e botar na geladeira até juntar monocárions suficientes para realizar os cruzamentos (lembra da tabela acima e lembra das 25% de taxa de cruzamento, precisa de MUITOS). Lembrem-se que a condição haplóide deve ser verificada tanto por aspectos visuais da colonia quanto através do microscópio, constatado pela ausência de grampos de conexão. Além disso da pra fazer teste de compatibilidade, eu não fiz mas se quiser pode.
O resultado não veio como eu esperava, no lugar de um cogumelo branco com esporos alaranjados (meu objetivo inicial), veio um cogumelo claro com esporos roxos. Provavelmente é mais de um gene que define a cor dos esporos. Talvez sejam 2 ou 3 genes, responsáveis pelo pigmento alaranjado, pelo pigmento roxo... talvez quando os 2 estão presentes a combinação de laranja com roxo confere ao esporo uma cor mais preta... enfim, tem algumas possibilidades mas só vou descobrir com o passar do tempo, é algo bem matemático pra ir monitorando e no fim a gente descobre melhor como controlar esse lance das cores... seguindo...
Doei esporos pra muita gente, não sei se as pessoas deram sequência no isolamento, me desvinculei de vários grupos de cultivo. Cena tá péssima...
Através de diversos cruzamentos de GEPETTO encontrei outra strain linda, chamei de MASCAVO. É uma linhagem derivada do GEPETTO. Ela possui pouca pigmentação no chapéu, igual o Gepetto, porém produz esporos castanho/alaranjados.
Ambas as strains, Gepetto e Mascavo, tinham uma característica interessantes nas hifas haplóides. ALGUMAS ERAM MARRONS. Já viu micélio de cubensis MARROM? Pois é, a princípio achei que era contaminação, porém acho que descobri uma coisa. Em breve eu confirmo, n vou dar spoiler. Seguimos...
Dito isso, venho aqui contar como foi o processo de criação da strain Gepetto, que tem feito sucesso por causa da produtividade, potência e facilidade no cultivo, além de serem cogumelos com aparência bem exótica (chapéu claro com esporos roxos), algo que eu nunca tinha visto antes (se bem que depois do Gepetto milagrosamente surgiram outras strains idênticas, claras com esporos roxos rs...)
Resolvi postar aqui pois já vi meia dúzia de cultivadores e vendedores mudando o nome da minha strain, renomeando, dizendo que é isolado de fulano, que ciclano trouxe de sei lá onde... Aquele mesmo papo de sempre né? Anos e mais anos nesse mundo de cultivadores e nada muda
Enfim, achei importante descrever aqui a história da strain (e das outras que vieram a partir dele) para que a história não se perca com o tempo, e aproveitar para ensinar o processo de cruzamento entre strains de cogumelos da espécie Psilocybe cubensis. Assim, mais gente consegue fazer também. Espero que gostem...Nos últimos anos tenho realizado muitos cruzamentos entre strains de diversas espécies de cogumelos, tanto comestíveis quanto cubensis, tudo feito em laboratório profissional, com a técnica correta descrita na literatura científica, nada de bro science, improviso ou "técnica alternativa que ouvi dizer por aí". Depois de centenas de cruzamentos e muita prática, venho dar algumas dicas.
1) É MUITO custoso cruzar strains $$$ vai muito material, são centenas de placas de Petri, muito meio de cultura, muita organização pra não se perder, equipamentos corretos etc...
Nenhum cultivo ou criação no mundo, do pé de alface à criação de gado, o criador irá passar pra frente uma genética fraca, ruim, pouco produtiva, doente. Com cogumelo não seria diferente. Para cruzar strains não basta botar 1 colônia haploide da strain A com outra colônia da strain B numa placa e pronto. É preciso fazer dezenas de cruzamentos entre essas strains, realizar o cultivo de cada um desses cruzamentos e SÓ AÍ decidir qual foi o melhor cruzamento entre a strain AxB, aquele indivíduo que você irá manter e passar pra frente, as outras são todas descartadas. A ideia é ter cada vez um cultivo melhor, não pior. Pense nisso na hora de passar ou adquirir uma cultura de alguém. Temos cães lindos de raça hoje em dia porque os criadores no passado escolheram sempre os melhores indivíduos, as melhores matrizes... Foco na genética bonita e produtiva, irmão. Nem toda mutação torta feia com baixa produtividade é uma coisa que deve ser levada adiante. Se fossem cães com defeito, certamente seriam sacrificados pra nem dar chance de reproduzir. Pense nisso quando for sua vez de cruzar strains.
Tendo isso em mente, saiba que apenas 25% das tentativas de cruzamento irão, de fato, cruzar. Cubensis é bifatorial heterotálico, lembre-se disso. 75% das placas vão para o lixo, por isso que eu uso placa tripartida pra cruzamentos e a placa de 60mm pra armazenamento dos monocárions. Dessas 25% que sobram, duas ou três strains valem a pena, o resto também é lixo. Dessas três, provavelmente uma será diferente dos parentais, as outras 2 precisará ir para a geração seguinte (F2) pra expressar os genes recessivos e talvez ter um fenótipo diferenciado. Então assim, não espere ter uma strain PICA em um semestre, porque não vai. É um trabalho de anos pra ter uma strain decente e que seja produtiva, de qualidade.
2) É FUNDAMENTAL usar a técnica correta, qualquer "tecnica alternativa" aumenta muito suas chances de estar cometendo um erro.
O erro mais comum que vejo por aí em grupos e fóruns é gente usando técnica alternativa pra cruzar strains, achando que conseguiram um monocarion isolado quando na verdade são vários monocarions juntos e a pessoa não percebe justamente pq isola "no olho", apenas observando o micélio, afinal ela não fez diluição seriada e teve que separar as colônias visualmente. Aí na hora de cruzar, as 2 colônias supostamente haploides eram na verdade várias colônias haploides erroneamente isoladas.
Aí o cara "cruza", ve o micélio rizomórfico na placa e acredita que cruzou strain A com B. Talvez nem tenha ocorrido AxB, mas sim AxA ou BxB, tendo em vista que se vc não faz diluição seriada, os esporos se comportam como cachos de uva, nunca a strain A vai cruzar com a B usando técnicas alternativas, sem quebrar tensão superficial da água com surfactante e posteriormente diluição seriada, vão acabar cruzando AxA ou BxB antes mesmo de ter uma AxB). Enfim, já vi de tudo, até gente que bota esporos da strain A e da strain B num frasco, agita e inocula, depois supostamente "caça" os fenótipos dos cruzamentos. Quem faz isso certamente esqueceu as primeiras aulas de genética, quando a professora ensinou sobre as ervilhas de Mendel
A técnica correta é a diluição seriada dos esporos da strain A e da strain B, depois plaqueamento em MEA ou BDA, isolamento das colônias haplóides, confirmação da ausência de grampos de conexão no microscópio e posteriormente o cruzamento. O cruzamento deve ser feito em placa tripartida, seguindo tabela mais ou menos igual a essa:
Alguns anos atrás resolvi cruzar TAT com RUST. Meu objetivo era um cogumelo branco igual o TAT mas com esporos alaranjados igual o RUST. Segue imagens dos parentais:
Pra começar a gente faz diluição seriada da strain A e da strain B
Para isso é necessário esterilizar ponteiras, pipeta e todos os materiais usados, além de claro, água destilada em tubos falcon com 9 ml de água com surfactante (eu usei tween 80). Em seguida é só fazer uma solução concentrada de esporos A e outra B e proceder com a diluição seriada. Quem quiser mais detalhes de como fazer, procure um PDF do André, da UNESP de rio claro sobre diluição seriada. Tem no google, é só adaptar.
Pegamos 1 ml dessa solução ultra concentrada de esporos e passamos para o tubo falcon seguinte, que possui 9ml de água destilada esteril com surfactante. Ou seja, diluimos 10x nossa solução (10-¹). Descartamos a ponteira da pipeta, agitamos o falcon em agitador vortex por 1 minuto, depois procedemos com a próxima diluição. Colocamos ponteira nova na pipeta, pipetamos 1 ml dessa solução 10-¹ e passamos para o tubo falcon seguinte, contento mais 9 ml. Agitamos no vortex e temos agora nossa solução 10-², e assim vamos até 10 a menos 6 talvez.
Ao final desse processo, você irá guardar os tubos falcon 10 a menos 4 até 10 a menos 6 da strain A e da strain B. Vai plaquear isso no meio de cultura usando 0,5 ml da solução com auxilio de uma alça de drigalski em dezenas de placas de petri de 90mm e vai incubar a 25´C.
Nessa primeira rodada você irá descobrir QUAL DILUIÇÃO resultou em uma melhor placa, ou seja, colônias DISTANTES ENTRE SI
O objetivo aqui é isolar o máximo de colônias haplóides possível em outras placas de 60mm, nomear cada uma (exemplo: TAT 1, TAT 2, TAT 3 etc.) e botar na geladeira até juntar monocárions suficientes para realizar os cruzamentos (lembra da tabela acima e lembra das 25% de taxa de cruzamento, precisa de MUITOS). Lembrem-se que a condição haplóide deve ser verificada tanto por aspectos visuais da colonia quanto através do microscópio, constatado pela ausência de grampos de conexão. Além disso da pra fazer teste de compatibilidade, eu não fiz mas se quiser pode.
O resultado não veio como eu esperava, no lugar de um cogumelo branco com esporos alaranjados (meu objetivo inicial), veio um cogumelo claro com esporos roxos. Provavelmente é mais de um gene que define a cor dos esporos. Talvez sejam 2 ou 3 genes, responsáveis pelo pigmento alaranjado, pelo pigmento roxo... talvez quando os 2 estão presentes a combinação de laranja com roxo confere ao esporo uma cor mais preta... enfim, tem algumas possibilidades mas só vou descobrir com o passar do tempo, é algo bem matemático pra ir monitorando e no fim a gente descobre melhor como controlar esse lance das cores... seguindo...
Através de diversos cruzamentos de GEPETTO encontrei outra strain linda, chamei de MASCAVO. É uma linhagem derivada do GEPETTO. Ela possui pouca pigmentação no chapéu, igual o Gepetto, porém produz esporos castanho/alaranjados.
Ambas as strains, Gepetto e Mascavo, tinham uma característica interessantes nas hifas haplóides. ALGUMAS ERAM MARRONS. Já viu micélio de cubensis MARROM? Pois é, a princípio achei que era contaminação, porém acho que descobri uma coisa. Em breve eu confirmo, n vou dar spoiler. Seguimos...
