Em Andamento C02 - O Destemido - PF/Casing TKSSS com Terrário Refrigerado

WoD

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Iniciando novas atividades hoje. Após conseguir êxito tomando todos os cuidados defendidos pela maioria dos growers, nesse cultivo eu adotarei uma abordagem mais natural sem tomar muitos cuidados e, deliberadamente, escolhendo abandonar alguns procedimentos considerados por alguns como essenciais.

Vamos lá:

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DIÁRIO DE CULTIVO
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STRAIN: TKSSS
PROCEDÊNCIA: Loja Digital

Obs: recebi a seringa a três meses atrás. Ela sobrou do meu primeiro cultivo. Durante este tempo, esteve guardada no fundo da geladeira, dentro de um ponte vedado.

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SUBSTRATO PARA COLONIZAÇÃO:
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(X) PF TEK (2V + 2,5FAI + 1A)
Selo com Vermiculita
(X) Sim ( ) Não

GRÃOS:
(X) Arroz Integral

Método de preparação e esterilização do substrato:

Nenhum cuidado de esterilização antes de ir pra panela de pressão. Substrato mexido em local aerado, sem proteção nenhuma (sem luva e sem máscara), com material não cozido não limpo de forma alguma. Vermiculita suja (com pedaços de saco dentro dela).

Mistura feita, foi para a panela de pressão ficando aproximadamente 1h e 20m. 20m para fazer pressão, 1h nas condições adequadas de esterilização.

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INOCULAÇÃO: Data 14/10/ 2018
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(X) Seringa Multiesporos

GloverBox?
( ) Sim (X) Não

Inoculação realizado no banheiro. Limpei usando desinfetante comum. Depois de limpar, passei cerca de 1h (enquanto preparava outras coisas), encharcando todas as superfícies, paredes e o que avaliei que fosse uma possível fonte de contaminantes com álcool 70. Deixei o ambiente completamente fechado. De forma que o cheiro de álcool dentro ficou bastante forte quando entrei para fazer a inoculação.

Não flambei a agulha, limpei-a bem usando álcool 70 e só.

O tamanho da agulha foi insuficiente, então tive que enfiar um pouco mais fundo dentro do copo abrindo um buraco bem grande e fazendo com que a ponta dela tocasse o selo de vermiculita. Cobri o furo com fita micropore, mas não pus uma tampa de alumínio por cima. Deixei a micropore exposta.

Foram inoculados 5 copos de 200ml cada um usando uma seringa de 5ml. Cada copo recebeu 1ml dividido em dois furos equidistantes com 0,5ml cada um.
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INCUBAÇÃO: Data 14/10/ 2018
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INCUBADORA:
Usei uma caixa de sapatos. Dentro dela pus um aquecedor de aquário grande com termostato incluso configurado para 30°. Pus um pano em cima (jeans velho) e fechei a caixa.

E é isso aí abiguinhos
 
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INOCULAÇÃO: Data 14/10/ 2018
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5º Dia de Incubação
- Sinais sutis de desenvolvimento de Micélio em dois copos. Foi preciso analisar com muita atenção pra ver os pequenos detalhes brancos nos flocos de arroz.
- De qualquer forma, vou pegar alguns carimbos feitos com o cultivo anterior e preparar alguma culturas líquidas e copos neste domingo. Só pra ter um cultivo de retaguarda. Vou manter a coleção de strains por culturas líquidas e carimbos.
- Aproveitei um tempo livre e fiz adicionei uma camada de alumínio aos copos, escondendo assim os furos, anteriormente cobertos apenas com uma camada de micropore. Fiz isso porque acredito que possa facilitar a manutenção da hidratação do substrato, evitando que a água se perca por estes furos.

ERRATA: eu coloquei o termostato pra 28° mesmo. Pensei que tinha posto 30°.
 
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INCUBAÇÃO: Data 14/10/ 2018
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10° dia de Incubação

- Cinco dos copos demonstram sinais claros de desenvolvimento com micélio bastante rizomórfico.
- Um dos copos não apresenta qualquer desenvolvimento visível.
- Iniciadas duas culturas líquidas de Albinos, visando aprendizagem e cultivo de reserva.
- Próximo checagem somente no 20° dia de incubação.



 

WoD

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Membro Ativo
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INCUBAÇÃO: Data 14/10/ 2018
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14° dia de Incubação

1 copo com 100% de ocupação da superfície. Neste copo em especial, fiz 4 furas equidistantes porque sobrou na agulha. Ou seja, fazer quatro furos pode tornar o processo mais rápido e garantir a velocidade de 20 dias.
4 copos estão oscilando entre 30 e 50%.

- Manchas amareladas em alguns dos copos. Possível contaminação bacterial. Vou aguardar evolução pra ter certeza. Seguem algumas fotos.

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Além da esterilização por calor, durante todo o processo utilizei somente alcool 70. Se confirmada a contaminação, evitarei utilizar somente esta substância para esterilização no futuro.

OBS: as fotos correspondem a dois copos diferentes. Não são representativas dos cinco copos inoculados.
 
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WoD

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Membro Ativo
Deu ruim negrada!

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photo-2018-11-01-12-05-23.jpg

Apesar do bom início com desenvolvimento rápido, na metade do caminho nos esbarramos com essa contaminação por bactéria.
Essas duas primeiras fotos são do mesmo copo, de faces diferentes, para vocês terem comparativo em relação a coloração amarelada.
Mesmo na face que está mais branca, a textura do micélio está algodoada, ou seja, ele parece estar lutando nessas regiões.
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Nessa última imagem, nós temos uma secção tranversão do bolo. Observe que a infecção se alimenta principalmente dos arroz. Ou seja, ela está competindo, mas não atacando o micélio.

De qualquer forma, como eu não sei o que é, e nem me interessa saber, os bolos foram desprezados.

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Essa foi minha primeira perda por contaminação, então pra não cair as lágrimas, vou transformar episódio em uma boa chance de aprendizagem:

Essa semana recebi do @l3th3 esporos selvagens de cubensis e paneulous. Como estágio pro isolamento, eu vou tentar isolar este micélio (um TKSSS), pra ver se obtenho êxito na remoção da contaminação!

Ou seja, este diário agora vai ser de uma clonagem e de uma tentativa de isolamento.

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INOCULAÇÃO POR CLONAGEM: Data 01/11/ 2018
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Selecionei um pedaço de micélio ainda bastante rizomórfico que estava brotando para fora do selo de vermiculita. Esse pedaço foi partido em 8, dos quais 5 foram postos em copos anteriormente esterilizado em panela de pressão.

Os cinco copos, apensar de uma semana guardados, não demonstravam sinais visíveis de nenhum tipo de contaminação. Eu removi as tampas de alumínio, peguei uma pequena tesourinha (antes imersa em álcool 70), cavei um furinho na lateral do copo, próximo a borda para que eu possa acompanhar o desenvolvimento e pus a secção de micélio. O processo, foi repetido nos cinco copos.

Feito isso tapei novamente com o alumínio, e passei fita isolante nas bordas.

Todo esse processo foi feito, abrindo somente um dos copos que estavam contaminados. Coletando micélio que estava acima do selo de vermiculita, eu espero não ter trazido contaminantes para o novo cultivo. Depois de fechados todos os copos, levei os contaminados para o jardim onde enterrei em locais longe do sol.

A temporada de chuva no NE é no final ano, onde as temperaturas alcançam até 25°. Será que eu consigo um outdoor? ;)

Os novos copos foram então para incubadora. Dessa vez pus 30° mesmo, obedecendo a recomendação do Psilocybin - Magis Mushroom Grower's Guide.

Esse procedimento tem baixa chance de dar certo, mas acho que serve como experiência para desenvolvimento de clonagem.

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ISOLAMENTO: Data 01/11/ 2018
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Fase 0 - Preparação.

Comprei placas petri de vidro (15x60, custando 3,90 cada)
Comprei agar comestível 100g por R$20,00 (uma fortuna, mas eu estava com pressa)
Comprei cremogema (R$ 4)

Seguirei a receita "Agar com cremogema do Psilo"
Outras receitas disponíveis aqui.
 

Kvasir

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Membro Novo
Parabéns mano, apesar da contaminação estragar nosso planos aprendemos muito nos adaptando e tentando remediar os problemas. Comecei essa semana um isolamento em placas petri de P. Cubensis e Pan Cyan selvagens que colhi, se tudo der certo eu posto um diário também.
 

WoD

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Membro Ativo
INOCULAÇÃO POR CLONAGEM: Data 01/11/ 2018
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Sem novidades

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ISOLAMENTO: 01/11/2018
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Fase 1 - Inoculação a partir de tecido de micélio.
02/11/2018

Fiz o ágar conforme descrito na postagem anterior, coloquei na petri e as pus dentro da panela de pressão, o que se provou ser um erro miserável. Boa parte delas acabou encharcando, só 5 ficaram em condições, das 19 preparadas. Por mais que eu tenha passado quase vinte minutos encaixando-as, tentando evitar que isto acontecesse, não teve jeito.

Montei uma SAB com uma tampa de vidro que tinha por aqui e a minha antiga glovebox (que dificultava bastante meus movimentos). Fiz todo o procedimento dentro de um quarto sem nenhuma entrada de ar, mas não lacrado (ou seja, havia troca de ar pelas frestas da porta).

Usei toca, luva e máscara cirúrgica. Todo o ambiente foi esterilizado primeiro com lyson e depois com álcool 70. Um borrifador contendo álcool 70 foi mantido dentro do espaço para borrifar o ambiente de vez em quando. Usei uma vela para esterilizar as ferramentas utilizadas (pinça cirúrgica e uma tesourinhas de unha em substituição do bisturi). O fogo da vela é insuficiente pra deixar a ferramenta incandescente, conforme as recomendações do RR em sua famosa coleção de videos. Mas acho que isso pode ser um exagero.

Ao fim, lacrei as placas com plástico filme.

Das 5 placas:
- 1 Inoculei com um pedaço de tecido de um bolo bastante promissor que tive no cultivo 01. Estava guardado na geladeira a pelo menos três meses em um pedacinho, não mais de 1cm³, de bolo.
- 4 inoculei com tecido do pedaço contaminado.

O processo é muito legal, mas extremamente cansativo. Principalmente pra mim que tive de organizar o espaço (diferente dos que usei anteriormente). Já estou traçando planos para corrigir os erros realizados dessa vez:
- Da próxima vez vou esterilizar as petri + ágar em um ponte dentro da panela de pressão e abrí-los somente no espaço planejado.
- Vou precisar de um bisturi pras próximas etapas. Acho que pode facilitar o serviço. Minha pinça cirúrgica, que veio junto com a balança, ajudou bastante dessa vez. Ferramentas sempre são a chave.

Bati as fotos, mas vou por só na próxima postagem para mostrar a comparação de cada placa.
 
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WoD

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Membro Ativo
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INOCULAÇÃO POR CLONAGEM:
Data 01/11/ 2018
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Condições de crescimento:
Fechados dentro de uma caixa de sapato com um aquecedor de aquário dentro de uma garrafa de vidro configurado para manter a temperatura em 30°
Temperatura ambiente oscilando entre 28° a 33°

Evolução
Dois copos demonstram sinais de micélios menores que uma unha.

Considerado o desenvolvimento lento se comparado com seringa multiesporos. Mas isto é o esperado.

Sem sinal de manchas amarelas nos copos.

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ISOLAMENTO: 01/11/2018
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Condições de crescimento:
Fechados dentro de uma caixa de madeira. Temperatura ambiente oscilando entre 28 a 33° nesta semana.

Evolução:
Resumo-1-3-6.jpg

Lamento a qualidade das fotos, mas a minha habilidade de fotógrafo ainda está em desenvolvimento kkk.

Estou um pouco preocupado com a qualidade do meio. Se você observar a placa 3, vai perceber que o micélio não parece estar se expandido com facilidade. Ao invés de termos uma expansão clara, ela mais parece uma mancha no substrato. Os outros não estão assim, mas parecem ter um desenvolvimento mais lento. Talvez seja também devido ao tempo que este micélio passou na geladeira.

Senti que o meio não ficou muito uniforme, a cremogema deixou pequenos nódulos visíveis quando se aproxima e observa a placa com atenção. Vou manter a receita, pela praticidade, mas pretendo tentar fazê-lo mais uniforme.

Estou me preparando para fazer um spawn de milho com o produto destes isolamentos.

OBS: as culturas líquidas que eu havia feito com alguns albinos que tenho mostraram resultado. Agora consigo distinguir o micélio na água e aparentemente não há contaminações.
 
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Membro Ativo
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INOCULAÇÃO POR CLONAGEM:
Data 01/11/ 2018
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21° Dia
Be-Funky-collage.jpg
Desenvolvimento bem lento se compararmos com uma seringa multiesporos.
No 16° dia, me dei conta que do 10° ao 16° dia a incubadora ficou mal coberta e é possível que o micélio tenha sido exposto a luz, o que pode ter colaborado para o atraso no seu desenvolvimento.

No 22°, já percebo uma expansão significativa de pelo menos 3 ou 4 ou cm.

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ISOLAMENTO:

1° 01/11/2018
2º 15/11/2018
3° 21/11/2018 - Finalizado por Contaminação.
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Algodoamento: característica genética ou sintoma?
Boa parte das placas cresceram bem, mas o desenvolvimento iluminou micélios algodoados. Achei curioso o fato de terem desenvolvido micélios assim, pois os copos aos quais foram removidos mostraram desenvolvimento rizomórfico até contaminarem, quando ficaram algodoados também.

Isso me fez perceber que o algodoamento não é uma característica genética, mas um sintoma da dificuldade do micélio de se expandir, seja por ter um meio não favorável ou por estar enfrentando uma infecção.

A recomendação de só picar micélios rizomórficos vem então na tentativa de selecionar o micélio que está melhor se adaptando aquele meio. Vejo um problema: isto seleciona o micélio que melhor se adapta ao meio em questão. Infelizmente os meios para placa petri possuem muito mais nutrientes do que os bolos, então fica a dúvida se de fato é possível fazer uma generalização desse tipo. O mais adequado seria estabelecer o meio de cultura ao qual eu usarei nos cultivos, mantê-lo de forma permanente. Cultivar micélios nele e isolar a partir de clonagem dos que demonstrarem melhor adaptação. As placas petris serão mantidas apenas para limpar raças que estejam contaminadas. Mesmo quando limpas, elas terão de ser frutificadas e os carimbos devem ser selecionados e isolados dentro do meio que eu optar por escolher. Complexo, mas interessante.

Acredito que o meio de seleção anterior não foi adequado por dois motivos: 1) a mistura com cremogema talvez não seja o melhor meio possível; 2) é possível que eu tenha posto muito pouco meio de cultura em cada uma das placas, o que dificultou o crescimento em algumas delas. O meio 2a, por exemplo, ficou parecido com uma estrela. Quando pus na luz, percebi que o padrão estelar estava relacionado a zonas da placa com menor disponibilidade de nutrientes, locais onde a camada de meio estava muito baixa.

Para tentar testar essa hipótese, fiz repique de apenas dos meios 3 e 2b. O 3 porque já vi seu crescimento supre agressivo em ação, então quis insistir um pouco mais e o 2b porque o produto final foi um círculo perfeito, mas algodoado. No novo recorte, eu acreditava que ambos demostrarão crescimento rizomórfico, pois dessa vez fiz BDA e pus uma boa quantidade de meio (cerca de 15ml nas placas de 60).

Desfecho:
1 - Desprezado. Crescimento irregular
2a - Crescimento irregular, aspecto estelar.
2b - Crescimento circular, mas algodoado.Transferido para um pote de milho de 500ml para colonização. Fiz um pequeno recorte para segundo isolamento.
2c - Crescimento circular, mas algodoado. Transferido para um pote de milho de 500ml para colonização.
3 - Crescimento irregular, com algumas áreas mais brancas do que outras. Transferido para um pote de milho de 500ml para colonização. Fiz um pequeno recorte para segundo isolamento.

2º Repique 15/11/2018
Agora, muito mais seguro, optei por realizar uma sessão de isolamento com diversas strains. O processo foi um fracasso. Está descrito melhor neste tópico:

O plano inicial era postar foto de 9 em 9 dias, segue um acompanhamento de evolução de 3 dias.
Isolamento-2.jpg

Os três contaminaram miseravalmente.
Ambos foram desprezados.
Os fungos competidores se desenvolveram assustadoramente mais rápido do que os micélios, quando estes começaram a se expandir, já estava quase que completamente cercados por competidores.

A reflexão sobre os motivos da contaminação seguem no post citado anteriormente.
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INOCULAÇÃO EM POTE DE VIDRO DE 500ml - 2º 15/11/2018
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Procedimento

- O preparo do milho foi baseado no seguinte tópico:
Casing - Milho de Pipoca - Substrato para Casing
1- Lavei o milho em duas águas.
2- Cozinhei por 30 min.
3- Descansou por 19h
4- Desprezei a água, pondo uma nova e adicionado duas colheres de hipoclorito.
5- Descansou por 4h.
6- Lavei em água corrente.
7- Foi para o frasco que então foi para a panela de pressão por 1h.​
- O procedimento foi realizado após a inoculação das placas Petri descritas no tópico acima, dentro de uma SAB. Foram utilizados uma espátula de cutícula¹ e uma pinça de dissecação de 14cm, ambos foram para a panela de pressão e a cada interação com os materiais tinham suas pontas queimadas em uma vela². Após fazer os devidos repiques e transferências (material 2b e 2c), apanhei as placas de interesse e raspei para dentro do milho. Chacoalhei de forma que o material ficasse no vidro e eu pudesse acompanhar seu desenvolvimento com clareza.

Dia 0
photo-2018-11-16-21-17-32.jpg
Dia 03
photo-2018-11-18-05-45-32.jpg

Rápido né? Pois bem, eu chacoalhei o bixo esperando aumentar o potencial de distribuição, mas no 6º dia. Não vi avanço algum em relação ao ao 3°. Chacoalhar parece ter lentificado a expansão do micélio. Vejo alguns grãos com micélio, mas não o vejo evoluindo entre os grãos.

Dia 6
photo-2018-11-21-20-50-00.jpg

Vou tentar não mexer mais, talvez olhar todo dia esteja atrapalhando :whistle:


No dia seguinte a inoculação deste primeiro frasco, peguei outro pote do mesmo tamanho que não havia cabido dentro da panela de pressão e transferi o isolamento da placa 3 para ele. Até o 6 dia, não parece ter havido nenhum tipo de crescimento. Ao que parece o tempo na geladeira danificou o crescimento do micélio. Ele está beeeeeem lento.


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¹: a espátula de cutícula mostrou-se uma alternativa muito mais fácil de encontrar do que um bisturi. Além de mais segura também. O modelo é exatamente esse.
²: quando eu punha o instrumento na vela, ele rapidamente enegrecia. Ao primeiro olhar achei que esse era um processo natural, mas depois verifiquei que esse material negro rapidamente se desfazia quando eu esfregava com papel toalha. Acredito que seja um resíduo fruto da queima da vela, o que sugere que seja melhor utilizar outro combustível. Vou providenciar uma lamparina de querosene.
 
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INOCULAÇÃO EM POTE DE VIDRO DE 500ml - 2º 15/11/2018
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Desprezado em 9/12/2018
- A decisão foi tomada após muito tempo sem dispersão do micélio no milho;
- Quando desprezei o milho estava com cheiro de chulé (possível contaminação bacterial reminescente);

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INOCULAÇÃO POR CLONAGEM:
Data 01/11/ 2018
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39º Dia
- 1 copo desprezado;
- 1 copo pro terrário;
- 1 copo permanece na incubadora, mas ainda tem sinais de contaminação. Acredito que vou acabar desprezando.
 

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Só finalizando:

O copo acabou por produzir um flush pequeno por volta do 53° dia. Depois passou mais 7 dias no terrário, onde apesar das condições ideais ressecou e começou a esverdear. Removi e dei aquela ultra limpada. Depois desse episódio dei uma pausa no cultivo e estou retomando agora.

Moral da História: Desprezar e recomeçar é mais fácil e menos frustrante.

Cultivo Encerrado
 
Superior