armazenamento a longo prazo de culturas em agar

tupy

★ vento sul ☆
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MÉTODOS DE CONSERVAÇÃO A LONGO TEMPO DE CULTURAS DE FUNGOS



Mais cedo ou mais tarde todo cultivador com um interesse em "cogumelos comestíveis" termina com uma coleção de culturas e, em seguida, há o problema de armazenamento.


Primeiro método: Agar Slants:
O método de armazenamento está em frascos inclinados com ágar e nutriente. Esse método funciona bem a curto prazo, mas muitas espécies começam a perder a viabilidade quando mantidas em um único nutriente por um período prolongado. A cada dois meses elas precisam ser movidas para um ágar com um nutriente diferente. Algumas linhagens de Agaricus parecem iniciar um processo de secagem, ao que parece agar não é o que preferem.


Segundo método: Óleo Mineral:
Sobrepor os frascos com óleo mineral estéril evita a amostra de secar, e atua como uma barreira ao oxigênio. O óleo aumenta o tempo entre as transferências em cerca de seis meses, no entanto, as culturas devem ser refrigeradas, e trabalhar com óleo é uma lambança.


Terceiro método: Refrigeração Profunda:
Seria realmente bom ter acesso a nitrogênio líquido, onde posso armazenar culturas a -196ºC, que essencialmente, para toda a atividade metabólica do fungo. Se eu tivesse esse recurso, as culturas se armazenariam por tempo indeterminado.

Eu tentei usar um freezer a -18ºC. A cultura é misturada com o glicerol (glicerina da farmácia) para evitar que os cristais de gelo danifiquem a cultura. Armazeno como um mingau congelado em frascos. Este método armazena muito bem, mas cultivadores geralmente não têm acesso a um freezer de boa qualidade que podem manter a temperatura constante.

Freezers de frigorífico ou os domésticos podem matar as culturas, como funcionam em ciclos altos e baixos de temperatura. Ocorre muita variação.


Quarto método: Pó de serragem de madeira:
A maioria das culturas colonizam em pó de serragem. Pequenos frascos de comida para bebê 03/02 cheio de serragem de madeira (80%), farelo de trigo (15%), gesso (5%) umedeça e esterilize. Os frascos são inoculados.

Quando estiver totalmente colonizado, podem ser refrigerados. (geladeira). Um único grão de cereal é transferido para uma placa de ágar para iniciar uma nova cópia. Este método armazena as culturas por mais de um ano.




Quinto método: Água Destilada:
Deparei-me com um artigo escrito por Michael D. Graham, microbiologista, que descreveu o armazenamento de leveduras em água destilada estéril. Que idéia brilhante! Permite que as culturas sejam armazenadas em temperatura ambiente, e mantém sua viabilidade por anos.

Água mineral estéril foi utilizada para preservar as culturas por Castellani em 1939 (2). Desde então, muitos cientistas têm utilizado este método; McGinnis et al. em 1974 (3) e Odds em 1991 (4) relataram que eles eram capazes de manter culturas viáveis por mais de três anos, sem degradação.

Método de armazenamento:

Obtenha frascos de um fornecedor de laboratório, preencha-os a cerca de metade do total (cerca de 3mL) com água destilada, afrouxe a tampa dos frascos e esterilize-os em uma panela de pressão por 30 minutos.

Cerca de seis mililitros de água destilada estéril é pipetada assepticamente em uma cultura de crescimento recente. Os fragmentos de hifas são retiradas raspando/cortando levemente uma parte bem rizomórfica , a suspensão resultante é retirada e transferida para um frasco de vidro esterilizado. (frasco suspenso) que irá ser armazenado.

Parafuse/rosqueie a tampa firme (que faz parte do frasco) ou arranje um outro método para isolar, envolva em plástico para ter certeza que ficou hermeticamente fechado. Quando você voltar daqui a alguns anos, não vai querer saber que a água evaporou.

Armazene os frascos em temperatura ambiente longe da luz solar direta. Uma estante ou armário de parede é um excelente lugar. Se as condições de temperatura se deterioram, e o quarto tornar-se insuportavelmente quente, os frascos podem ser refrigerados.

Para despertar a cultura:

Sob condições assépticas, basta mergulhar um pedaço da cultura dentro de frasco estéril, com um pouco da água do micélio em uma placa de ágar. Ele vai começar a reanimar, estando em uma fonte de nutrientes e oxigênio.

Os quatro primeiros métodos mantém as culturas vivas, com: alimento, água e oxigênio. Se eles não dispõem de qualquer destes, é óbito ao fungo. Em vez de tentar mantê-los vivos, existe uma maneira melhor: em água destilada estéril, sem comida, oxigênio, ou minerais.

Este método foi utilizado há quase 60 anos, mas aparentemente foi perdido devido à falta de comunicação.

(First published in in _Mushroom,the Journal_, Winter 1998 edition, with clarifications added by the author, April 1998.)

Copyright©1998 by Joseph C. Kish, All Rights Reserved.


Referencias

(1) M.D.Graham, "A Simple,Practical Method for Long Term Storage of Yeast", Brewing Techniques 5, March/April (1997), pp 58-62

(2) S.Castellani,"Viability of Some Pathogenic Fungi in Distilled Water", Journal of Tropical Medicine and Hygiene 42, pp 225-226 (1939)

(3) M.R.McGinnis,A.A.Padhye,and L. Ajello,"Storage of Stock Cultures of Filamentous Fungi,Yeasts, and Some Aerobic Actinomycetes in Sterile Distilled Water", Applied Microbiology 28, pp 218-222 (1974)

(4) F.C.Odds, "Long Term Laboratory Preservation of Pathogenic Yeast in Water",Journal of Medical and Veterinary Mycology 29, pp 413-415(1991)




Essa água estéril pode ser adquirida em farmácias, evite de fazê-la em casa. Experiência própria, tempos atrás comprei essa tal de "água estéril" onde nem os esporos de fungos conseguiram se propagar, pois é uma água sem nutrientes. 1L dessa água custa em torno de R$5,00.
Uma água sem nutrientes ou minérios que podem despertar o fungo.
Em um ambiente de água estéril, a cultura entra em um estado de dormência (fica estagnado).


Mais métodos em água:

PROCEDIMENTOS:

"Uma técnica simples é fazer crescer a cultura em agar e manter pequenos pedaços de agar colonizados flutuando em água desmineralizada".

01) Se frascos de 100 ml são utilizados, estes devem estar preenchidos com 75 ml de água desmineralizada.

02) Esterilizar os frascos por duas horas, deixe esfriar, em seguida, transferir assepticamente pequenos pedaços da cultura em ágar. Coloque cerca de 3-4 peças de 0,5 x 0,5 centímetros quadrados em cada frasco.

03) Inocular sempre pelo menos três frascos com cada strain, assim, se de algum modo ocorrer contaminação, há ainda uma garantia, um backup.

Oei, Peter. 1991. MANUAL ON MUSHROOM CULTIVATION - TECHNIQUES, SPECIES AND OPPORTUNITIES FOR COMMERCIAL APPLICATIONS IN DEVELOPING COUNTRIES. Transfer of Technology for Development (Amsterdam) and Technical Center for Agricultural and Rural co-operation (Wageningen), ISBN 90 70857 22 7, p 256.



"CONSERVAÇÃO EM ÁGUA O método utilizado é o seguinte:

01) 6 milímetros de ágar em cubos são cortados a partir da borda de crescimento de uma colônia de fungos

02) Os blocos são colocados em água destilada estéril em frascos de "McCartney" e as tampas são bem apertadas/rosqueadas, estes são armazenados em 20-25º graus centígrados. Colocando-se o micélio para baixo, em um meio adequado, períodos de armazenamento de 2-3 anos têm sido obtidos com espécies de Phytophthora e Pythium antes de qualquer perda de viabilidade ser observada (Cebola & Smith, 1984).

Importante: O crescimento do micélio pode ocorrer algumas vezes durante o armazenamento em água. Este será reduzido ou até anulado se os esporos ou hifas foram removidos da superfície do ágar e nenhum meio for transferido juntamente.

Este método de armazenamento foi inicialmente descrito por Castellani (1939 , fungos 1967) Figueiredo (1967) Figueiredo & Pimentel (1975), posteriormente notificados 10 anos de armazenamento com êxito por esse meio. Boeswinkel (1976) armazenados 650 patógenos de plantas, incluindo representantes dos Oomycota, Ascomycota, Basidiomycota e fungos mitótico. Todos eles permaneceram viáveis e patogênicos de 7 anos. Clark & Dick (1974) relataram bons resultados com Oomycota, Ellis (1979) com Entomophthorales, PYRENOMYCETES, Hymenomycetes, Gasteromycetes e Hyphomycetes, e Marx e Daniel (1976) com fitopatógenos ectomicorrízicos.


References:

Boeswinkel, H.J. (1976) Storage of fungal cultures in water. TRANSACTIONS OF THE BRITISH MYCOLOGICAL SOCIETY 66, 183-185.

Castellani, A. (1939) Viability of some pathogenic fungi in sterile distilled water. JOURNAL OF TROPICAL MEDICINE AND HYGIENE 42, 225-226.

Castellani, A. (1967) Maintenance and cultivation of common pathogenic fungi of man in sterile distilled water. Further researches. JOURNAL OF TROPICAL MEDICINE AND HYGIENE 70, 181- 184

Ellis, J.J. (1979) Preserving fungus strains in sterile water. MYCOLOGIA 71, 1072-1075

Figueiredo, M.B. (1967) Estudes sobre a aplicacao de Castellani para conservacao de fungos patogenos en plantas. BIOLOGICO 33, 9-15.

Figueiredo, M.B. & Pimentel C.P.V. (1975) Metodos utilizados para conservacao de fungos na micoteca de Secao de Micologia Fitopatologica de Instituto Biologico. SUMMA PHYTOPATHOLOGICA 1, 299-302 Marx,

D.H. & Daniel, W.J. (1976) Maintaining cultures of ectomycorrhizal and plant pathogenic fungi in sterile water cold storage. CANADIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY 22, 338-341

Onions, A.H.S.&Smith, D. (1984) Current status of culture preservation and technology. In: CRITICAL PROBLEMS OF CULTURE COLLECTIONS (edited by L.R. Batra&T. Iigima). Osaka: Institute of Fermentation Osaka"



Tradução livre do inglês em 01 de setembro de 2010.
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Amor decompositor
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Muito importante também é conservar culturas de micélio!! Grato!
 

MoKsha

Primórdia
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Uma dúvida...

Hoje preparei 17 placas de PDA (mais tarde posto no meu diário de cultivo falando sobre).
Só usei 3 por enquanto, as outras são pras sucessivas transferências. Queria saber como devo conservar esses meios que ainda não estão inoculados. Geladeira? Freezer?
 

mantonelli

Oompa Loompa, do-ba-dee-doo
Membro Ativo
Uma dúvida...

Hoje preparei 17 placas de PDA (mais tarde posto no meu diário de cultivo falando sobre).
Só usei 3 por enquanto, as outras são pras sucessivas transferências. Queria saber como devo conservar esses meios que ainda não estão inoculados. Geladeira? Freezer?
Pode deixar na geladeira, mas as placas precisam estar bem protegidas para evitar contaminações.
Eu guardo as minhas em um saco zip-lock e procuro retirar todo o excesso de ar dele.

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