- 21/01/2005
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Ramificações de culturas de multiesporos
Cultura de multiesporos é a forma mais simples de se obter uma linhagem viável, senão absolutamente pura. A germinação de tal multidão de esporos, de fato cria muitas linhagens, algumas incompatíveis com outros e cada qual é potencialmente diferente na maneira e grau em que frutificam sob condições artificiais. Nesta mistura, certas linhagens inibem a atividade de outras mais produtivas. No geral linhagens criadas de esporos tem uma boa probabilidade de se parecerem com seus pais. Se tais pais foram domesticados e frutificam bem em condições laboratoriais, espera-se que seus filhos tenham o mesmo comportamento. Em contraste, culturas de espécimens selvagens podem frutificar muito fracamente em um ambiente artificial. Assim como plantas selvagens, linhagens de cogumelos selvagens devem ser seletivamente desenvolvidas.
Das muitas linhagens recentemente criadas intrinsicamente para germinação multiesporos, algumas só podem ser capazes de crescimento vegetativo. Tal micélio pode assimilar nutrientes mas não pode formar um corpo de frutificação (o produto do crescimento "gerador"). Uma rede de células originarias de um único esporos é chamado de monocarióide. Por via de regra, monocarióides não são capazes de produzir cogumelos que produzem esporos. Quando duas hifas monocarióides se encontram e se cruzam, material citoplasmático e genético é trocado. O micélio resultante é um dicarióide que pode produzir uma prole fértil na forma de cogumelos. Ramificação ou "fazer redes" [networking não tem uma tradução exata para português, provavelmente faltam palavras q consigam tornar esse termo mais conciso em uma palavra só] entre diferentes linhagens dicarióticas é conhecido como anastomose [comunicação entre dois vasos sangüíneos ou outras formações tubulares]. Esse processo de recombinação pode ocorrer em qualquer estágio do processo do cultivo: no agar; em grãos; em substratos mais pesados (grandes pilhas de composto). O cruzamento de diferentes linhagens de cogumelos é análoga a criação de híbridos na horticultura.
Outro método para começar culturas é a criação de um único esporo "isolado" e é conseguido diluindo esporos em um volume de água estéril. Esta solução de esporos é então diluída em maiores volumes de água estéril que é então utilizada para inocular meios de culturas. Desta forma, cultivadores podem observar monocarióides individuais e de uma forma controlada instituir um calendário de cruzamento para o desenvolvimento de linhagens de alta produtividade. Para cultivadores interessados somente em obter uma cultura viável, esta técnica é desnecessária e germinações multiesporos são geralmente suficientes. Mas para aqueles interessados no cruzamento de linhagens monocarióticas e estudar características de cruzamento este método é de grande valia.
Tenha em mente que para cada 100 esporos, apenas uma média de 1 a 5 germinam. Para maiores explicações sobre linhagens e genética das linhagens veja o capítulo XV.
O maior perigo em fazer germinações multiesporos concentradas é a chance maior de contaminação, especialmente de bactérias. Algumas bactérias parasitam as paredes celulares do micélio, enquanto outras estimulam germinação dos esporos apenas para ser carregada e lentamente digerir o micélio resultante. Portanto algumas linhagens são naturalmente fracas e tendem a ser associadas a uma alta percentagem de contaminações. Estes esporos infectados aumentam a probabilidade de proliferação de doenças para esporos vizinhos quando a germinação é efetuada em números tão grandes. Muitos fungos, entretanto, desenvolveram um raro relacionamento simbiótico com outros microorganismos. Algumas bactérias e leveduras estimulam germinação de esporos em cogumelos que em outras situações seriam difíceis de serem cultivados em culturas estéreis. Os esporos do Cantharellus cibarius, o comum e altamente premiado Chantrelle [me esqueci o nome popular dele por aqui], não germinam em condições artificiais, resistindo aos esforços dos micologistas mais experientes do mundo. Recentemente, Nils Fries (1979), um micologista suíço, descobriu que quando carvão ativado e levedura vermelha, Rhodotorula glutinis (Fres. [?]) Harrison, foram acrescentadas ao meio, a germinação de esporos seguia logo em diante (carvão ativado é recomendado para qualquer cogumelo cujos esporos não germinam facilmente).
Muitos cultivadores vem reportando que certas culturas crescem bem quando uma bactéria acidentalmente contamina ou é propositalmente introduzida em uma cultura. Pseudomonas putida. Bacillus megaterium, Azotobacter vinalandii e outros provaram ter efeitos estimulatórios em várias espécies de cogumelos- sejana germinação de esporos, no crescimento do micélio ou na formação de corpos de frutificação. Entretanto, a maioria dos contaminantes que são encontrados no cultivo de cogumelos, sejam do ar ou intrínsecas à cultura, não auxiliam em nada. As bactérias podem ser os mais nefastos dos competidores. Um regime diligente de higiene, a utilização de filtros HEPA e boas técnicas de laboratório conseguem eliminar estes contaminantes custosos.
Setorização: Seleção e desenvolvimento de linhagens.
Quando um micélio cresce em um agar nutritivo (meio de cultura), ele pode apresentar uma impressionante diversidade de formas. Alguns micélio são bem uniformes quanto à aparência; outros podem ser polimorfos inicialmente e rapidamente se desenvolverem em um micélio de aparência homogênea. Esta é a natureza do micélio dos cogumelos - mudar constantemente e evoluir.
Quando um micélio cresce em um único foco de inoculação e vários tipos divergentes apareçem, diz-se que ele está "setorizando". Um setor é definido unicamente em contraste com o micélio predominante ao seu redor.
Existem duas grandes classes de setores miceliais: rizomórficos (corda, trançado) e tomentose (algodoado). Um tipo intermediário de micélio ocorre que cresce linearmente (longitudinalmente radial [?]) mas não tem fios tortos de hifas entrelaçadas que caracterizam o tipo rizomórfico.
Micélio rizomórfico é muito mais apto a produzir primordia. Micélio linear também pode produzir primordia abundantemente mas isto normalmente ocorre assim que forma rizomorfos. Entretanto, tenha em mente que as caraterísticas do micélio frutificante são específicas as espécies em si e podem não conformar-se precisamente com as categorias listadas aqui.
Num pote que está largamente coberto com um micélio algodoado, um leque de micélio trançado seria chamado de setor rizomórfico, e vice versa. Setores são comuns na cultura de cogumelos e apesar de que pouco se conhece sobre as causas e funções, está claro que a genética, nutrição e a idade do micélio tem papéis importantes.
De acordo com Stoller, o crescimento de setores cobertos de penugem é encorajado pelos núcleos [dos grãos] que foram quebrados e expostos que aumentam a disponibilidade de amido nas sementes [termo de micologia que se refere à um momento específico do cultivo comercial]. Trabalhando com o Agaricus brunnescens, Stoller notou que apesar do crescimento micelial ser rápido em níveis altos de pH (7.5) do que em níveis levemente ácidos de pH (6.5), a setorização é mais frequente. Ele descobriu que setores em grãos podem ser reduzidos evitando-se o uso de grãos "explodidos" [expostos] (uma consequência de água em excesso) e tamponando o pH a 6.5 usando uma combinação de giz (carbonato de cálcio precipitado) e gesso (sulfato de cálcio). Cultivadores comerciais de Agaricus à muito perceberam que o lento micélio algodoado é inferior ao crescimento rápido do micélio rizomórfico. Existe uma aparente correlação entre micélio algodoado no agar e as ocorrência posteriores de "estroma", um crescimento denso, como um tapete de micélio, sobre os casings que raramente produzem cogumelos.
Ainda mais, primordia formam-se frequentemente pelos rizomorfos orientados de forma frutífera [?] mas raramente entre um micélio algodoado disposto de forma somática. É de interesse mencionar que, sob um microscópio, as hifas de um micélio rizomórfico são mais largas e se dividem menos frequentemente do que a rede micelial algodoada.
Micélio rizomórfico corre rápido, forma mais primordia e na análise final produz mais cogumelos do que o micélio algodoado. Um exemplo disso está ilustrado na fig. 37. Uma única lasca de micélio foi transferida para um placa de petri e dois tipos miceliais distintos cresceram disto. O setor com mais "cordas" formou primordia abundante enquanto o setor algodoado não formou, um evento comum na cultura de agar.
Quando um micélio fica velho, é dito que está senescendo. Micélio senescente, como qualquer planta ou animal velho, é bem menos vigorosa e fértil que a sua contraparte [micélio jovem]. No geral, uma mudança de micélio com aparência rizomórfica para algodoada deve ser um alerta para que a degeneração da linhagem tenha começado.
If at first a culture is predominantly rhizomorphic, and then it begins to sector, there are several measures that can be undertaken to promote rhizomorphism and prevent the strain's degeneration.
1. Propague apenas os setores rizomórficos e evite os algodoados.
2. Altere o meio regularmente usando as formulas descritas aqui. Cultivando uma linhagem na mesma fórmula de agar não é recomendada por que a composição nutricional do meio exerce uma influência seletiva na abilidade de produção de enzimas digestivas do micélio. Variando o meio, o sistema de enzimas da linhagem permanece amplo e o micélio é mais apto a sobreviver. Espécies variam bastante nas suas preferências. A não ser que dados específicos estejam disponíveis, tentativa e erro é o único recurso.
3. Apenas cresça a quantidade de micélio necessário para a produção das "sementes" e retorne a linhagem para o estoque quando não estiver em uso. Não espere que o micélio que foi cultivado durante vários anos em temperaturas ótimas relembre a cultura primária de onde veio. Após tantas divisões celulares e transferências contínuas, é provável que uma sub-linhagem tenha sido selecionada, uma q pode relembrar de longe a original, na vitalidade, aparência micelial e potencial de frutificação.
4. Se tentativas de preservar uma linhagem vital falharem, re-isole novas sub-linhagens de germinações multi-esporos.
5. Uma outra alternativa é experimentar continuadamente com a criação de linhagens híbridas que são formadas do cruzamento de micélio dicariótico de dois pais geneticamente distintos. (experimentos com Agaricus brunnescens mostraram, entretanto, que a maioria dos híbridos produzem menos do q ambas ou apenas uma das linhagens em questão. Uma minoria dos híbridos resultam em linhagens mais produtivas.)
Cultivadores amadores podem desenvolver seletivamente linhagens de cogumelos ao classificar o micélio de acordo com as seguintes características. Estas características são:
Cultura de multiesporos é a forma mais simples de se obter uma linhagem viável, senão absolutamente pura. A germinação de tal multidão de esporos, de fato cria muitas linhagens, algumas incompatíveis com outros e cada qual é potencialmente diferente na maneira e grau em que frutificam sob condições artificiais. Nesta mistura, certas linhagens inibem a atividade de outras mais produtivas. No geral linhagens criadas de esporos tem uma boa probabilidade de se parecerem com seus pais. Se tais pais foram domesticados e frutificam bem em condições laboratoriais, espera-se que seus filhos tenham o mesmo comportamento. Em contraste, culturas de espécimens selvagens podem frutificar muito fracamente em um ambiente artificial. Assim como plantas selvagens, linhagens de cogumelos selvagens devem ser seletivamente desenvolvidas.
Das muitas linhagens recentemente criadas intrinsicamente para germinação multiesporos, algumas só podem ser capazes de crescimento vegetativo. Tal micélio pode assimilar nutrientes mas não pode formar um corpo de frutificação (o produto do crescimento "gerador"). Uma rede de células originarias de um único esporos é chamado de monocarióide. Por via de regra, monocarióides não são capazes de produzir cogumelos que produzem esporos. Quando duas hifas monocarióides se encontram e se cruzam, material citoplasmático e genético é trocado. O micélio resultante é um dicarióide que pode produzir uma prole fértil na forma de cogumelos. Ramificação ou "fazer redes" [networking não tem uma tradução exata para português, provavelmente faltam palavras q consigam tornar esse termo mais conciso em uma palavra só] entre diferentes linhagens dicarióticas é conhecido como anastomose [comunicação entre dois vasos sangüíneos ou outras formações tubulares]. Esse processo de recombinação pode ocorrer em qualquer estágio do processo do cultivo: no agar; em grãos; em substratos mais pesados (grandes pilhas de composto). O cruzamento de diferentes linhagens de cogumelos é análoga a criação de híbridos na horticultura.
Outro método para começar culturas é a criação de um único esporo "isolado" e é conseguido diluindo esporos em um volume de água estéril. Esta solução de esporos é então diluída em maiores volumes de água estéril que é então utilizada para inocular meios de culturas. Desta forma, cultivadores podem observar monocarióides individuais e de uma forma controlada instituir um calendário de cruzamento para o desenvolvimento de linhagens de alta produtividade. Para cultivadores interessados somente em obter uma cultura viável, esta técnica é desnecessária e germinações multiesporos são geralmente suficientes. Mas para aqueles interessados no cruzamento de linhagens monocarióticas e estudar características de cruzamento este método é de grande valia.
Tenha em mente que para cada 100 esporos, apenas uma média de 1 a 5 germinam. Para maiores explicações sobre linhagens e genética das linhagens veja o capítulo XV.
O maior perigo em fazer germinações multiesporos concentradas é a chance maior de contaminação, especialmente de bactérias. Algumas bactérias parasitam as paredes celulares do micélio, enquanto outras estimulam germinação dos esporos apenas para ser carregada e lentamente digerir o micélio resultante. Portanto algumas linhagens são naturalmente fracas e tendem a ser associadas a uma alta percentagem de contaminações. Estes esporos infectados aumentam a probabilidade de proliferação de doenças para esporos vizinhos quando a germinação é efetuada em números tão grandes. Muitos fungos, entretanto, desenvolveram um raro relacionamento simbiótico com outros microorganismos. Algumas bactérias e leveduras estimulam germinação de esporos em cogumelos que em outras situações seriam difíceis de serem cultivados em culturas estéreis. Os esporos do Cantharellus cibarius, o comum e altamente premiado Chantrelle [me esqueci o nome popular dele por aqui], não germinam em condições artificiais, resistindo aos esforços dos micologistas mais experientes do mundo. Recentemente, Nils Fries (1979), um micologista suíço, descobriu que quando carvão ativado e levedura vermelha, Rhodotorula glutinis (Fres. [?]) Harrison, foram acrescentadas ao meio, a germinação de esporos seguia logo em diante (carvão ativado é recomendado para qualquer cogumelo cujos esporos não germinam facilmente).
Muitos cultivadores vem reportando que certas culturas crescem bem quando uma bactéria acidentalmente contamina ou é propositalmente introduzida em uma cultura. Pseudomonas putida. Bacillus megaterium, Azotobacter vinalandii e outros provaram ter efeitos estimulatórios em várias espécies de cogumelos- sejana germinação de esporos, no crescimento do micélio ou na formação de corpos de frutificação. Entretanto, a maioria dos contaminantes que são encontrados no cultivo de cogumelos, sejam do ar ou intrínsecas à cultura, não auxiliam em nada. As bactérias podem ser os mais nefastos dos competidores. Um regime diligente de higiene, a utilização de filtros HEPA e boas técnicas de laboratório conseguem eliminar estes contaminantes custosos.
Setorização: Seleção e desenvolvimento de linhagens.
Quando um micélio cresce em um agar nutritivo (meio de cultura), ele pode apresentar uma impressionante diversidade de formas. Alguns micélio são bem uniformes quanto à aparência; outros podem ser polimorfos inicialmente e rapidamente se desenvolverem em um micélio de aparência homogênea. Esta é a natureza do micélio dos cogumelos - mudar constantemente e evoluir.
Quando um micélio cresce em um único foco de inoculação e vários tipos divergentes apareçem, diz-se que ele está "setorizando". Um setor é definido unicamente em contraste com o micélio predominante ao seu redor.
Existem duas grandes classes de setores miceliais: rizomórficos (corda, trançado) e tomentose (algodoado). Um tipo intermediário de micélio ocorre que cresce linearmente (longitudinalmente radial [?]) mas não tem fios tortos de hifas entrelaçadas que caracterizam o tipo rizomórfico.
Micélio rizomórfico é muito mais apto a produzir primordia. Micélio linear também pode produzir primordia abundantemente mas isto normalmente ocorre assim que forma rizomorfos. Entretanto, tenha em mente que as caraterísticas do micélio frutificante são específicas as espécies em si e podem não conformar-se precisamente com as categorias listadas aqui.
Num pote que está largamente coberto com um micélio algodoado, um leque de micélio trançado seria chamado de setor rizomórfico, e vice versa. Setores são comuns na cultura de cogumelos e apesar de que pouco se conhece sobre as causas e funções, está claro que a genética, nutrição e a idade do micélio tem papéis importantes.
De acordo com Stoller, o crescimento de setores cobertos de penugem é encorajado pelos núcleos [dos grãos] que foram quebrados e expostos que aumentam a disponibilidade de amido nas sementes [termo de micologia que se refere à um momento específico do cultivo comercial]. Trabalhando com o Agaricus brunnescens, Stoller notou que apesar do crescimento micelial ser rápido em níveis altos de pH (7.5) do que em níveis levemente ácidos de pH (6.5), a setorização é mais frequente. Ele descobriu que setores em grãos podem ser reduzidos evitando-se o uso de grãos "explodidos" [expostos] (uma consequência de água em excesso) e tamponando o pH a 6.5 usando uma combinação de giz (carbonato de cálcio precipitado) e gesso (sulfato de cálcio). Cultivadores comerciais de Agaricus à muito perceberam que o lento micélio algodoado é inferior ao crescimento rápido do micélio rizomórfico. Existe uma aparente correlação entre micélio algodoado no agar e as ocorrência posteriores de "estroma", um crescimento denso, como um tapete de micélio, sobre os casings que raramente produzem cogumelos.
Ainda mais, primordia formam-se frequentemente pelos rizomorfos orientados de forma frutífera [?] mas raramente entre um micélio algodoado disposto de forma somática. É de interesse mencionar que, sob um microscópio, as hifas de um micélio rizomórfico são mais largas e se dividem menos frequentemente do que a rede micelial algodoada.
Micélio rizomórfico corre rápido, forma mais primordia e na análise final produz mais cogumelos do que o micélio algodoado. Um exemplo disso está ilustrado na fig. 37. Uma única lasca de micélio foi transferida para um placa de petri e dois tipos miceliais distintos cresceram disto. O setor com mais "cordas" formou primordia abundante enquanto o setor algodoado não formou, um evento comum na cultura de agar.
Quando um micélio fica velho, é dito que está senescendo. Micélio senescente, como qualquer planta ou animal velho, é bem menos vigorosa e fértil que a sua contraparte [micélio jovem]. No geral, uma mudança de micélio com aparência rizomórfica para algodoada deve ser um alerta para que a degeneração da linhagem tenha começado.
If at first a culture is predominantly rhizomorphic, and then it begins to sector, there are several measures that can be undertaken to promote rhizomorphism and prevent the strain's degeneration.
1. Propague apenas os setores rizomórficos e evite os algodoados.
2. Altere o meio regularmente usando as formulas descritas aqui. Cultivando uma linhagem na mesma fórmula de agar não é recomendada por que a composição nutricional do meio exerce uma influência seletiva na abilidade de produção de enzimas digestivas do micélio. Variando o meio, o sistema de enzimas da linhagem permanece amplo e o micélio é mais apto a sobreviver. Espécies variam bastante nas suas preferências. A não ser que dados específicos estejam disponíveis, tentativa e erro é o único recurso.
3. Apenas cresça a quantidade de micélio necessário para a produção das "sementes" e retorne a linhagem para o estoque quando não estiver em uso. Não espere que o micélio que foi cultivado durante vários anos em temperaturas ótimas relembre a cultura primária de onde veio. Após tantas divisões celulares e transferências contínuas, é provável que uma sub-linhagem tenha sido selecionada, uma q pode relembrar de longe a original, na vitalidade, aparência micelial e potencial de frutificação.
4. Se tentativas de preservar uma linhagem vital falharem, re-isole novas sub-linhagens de germinações multi-esporos.
5. Uma outra alternativa é experimentar continuadamente com a criação de linhagens híbridas que são formadas do cruzamento de micélio dicariótico de dois pais geneticamente distintos. (experimentos com Agaricus brunnescens mostraram, entretanto, que a maioria dos híbridos produzem menos do q ambas ou apenas uma das linhagens em questão. Uma minoria dos híbridos resultam em linhagens mais produtivas.)
Cultivadores amadores podem desenvolver seletivamente linhagens de cogumelos ao classificar o micélio de acordo com as seguintes características. Estas características são:
- Rizomorfismo - micélio vegetativo de rápido crescimento.
- Pureza da linhagem - falta de setores algodoados.
- Limpeza do micélio - falta de organismos competidores (bactérias, bolores e insetos)
- Tempo de resposta às condições de formação de primordia.
- Número de primordia formado.
- Proporção de primordia que cresce até a maturidade.
- Tamanho, formato e/ou cor dos corpos de frutificação.
- Produtividade total.
- Resistência à doenças.
- Tolerância/sensibilidade ao gás carbônico.
- Limites de temperatura.
- Facilidade de colher.