- 15/06/2025
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*Nesse tópico vou abordar tudo sobre culturas liquidas, junto também de um tutorial completo de como fazer a sua própria CL, esterilizar, inocular, incubar e identificar contaminantes.*
Obs: No geral, usar apenas açúcar funciona muito bem, no entanto, fornecer nutrientes além do açúcar é desejável se quiser manter o micélio com o máximo de vitalidade possível, isso pode ser alcançado com alguns ingredientes de fácil acesso.
Podemos citar os principais ingredientes usados para a produção de uma CL:
Segue foto de um recipiente adequado para CL's:
Nesses recipientes foram utilizados apenas vidros de azeitona, borrachas de penicilina e filtros adesivos que podem ser achados facilmente na internet por um preço acessível.
Para começar, após ter decidido quantas ml de cultura liquida quer fazer, pegue essa mesma quantidade de água e passe por um filtro de papel ou de café (muito bem lavado para não conter impurezas), passe cerca de 2 a 3 vezes e dps ferva (tome cuidado para que ela não ferva por muito tempo, pois com isso a água irá evaporar e consequentemente terá menos água para diluir os ingredientes, deixando a CL mais concentrada do que deveria), após ferver, coloque em um recipiente MUITO limpo para não deixar a água com impurezas.
Em seguida, com a água ainda quente, misture o ingrediente na concentração adequada; nesse caso usarei dextrose em uma concentração de 0,9%;
No total fiz 3 frascos de CL, cada um contendo 200ml, totalizando 600ml, ou seja, 0,9% de 600 é 5,4; então tenho que diluir 5,4 gramas de dextrose em 600ml de água, segue um "diagrama" para facilitar o entendimento:
0,9% = Concentração fixa de dextrose que a solução deve ter
600ml = Volume Total de água
200ml = Volume em cada um dos potes que estou fazendo (totalizando 200)
600 x 0,009 = 5,4 ----> 5,4 gramas de dextrose diluídos em 600ml de água
600ml de Cultura liquida ----> 600/3 = 200ml em cada pote
Após o preparo da solução, passe ela em um filtro despejando ela nos recipientes (filtrar novamente serve para filtrar partículas e impurezas da dextrose que não se dissolveram na solução)
Antes ou após colocar a solução nos potes, coloque pedaços de vidro ou bolinhas de gude dentro do recipiente (isso ajuda a quebrar o micélio em fragmentos menores, ajudando na colonização e posteriormente na aspiração da CL).
Obs: Elas devem estar completamente limpas, lave diversas vezes e tenha certeza de não haver nenhum resquício de sujeira neles antes de colocá-los na CL)
Segue fotos de como sua solução deve estar:
Repare em como a solução está límpida, sem partículas suspensas no meio e nenhum tipo de turbidez.
O elástico é opcional.
Após isso, pegue sua panela de pressão, coloque um pano no fundo dela e encha cerca de 4 a 5 dedos de água; coloque os potes dentro da panela e feche.
Ligue no fogo alto e deixe assim até que a panela comece a chiar fortemente, após isso deixe no fogo baixo por cerca de 35 minutos contando desde quando a panela pegou pressão e começou a "chiar".
Obs: a panela deve estar "chiando" durante esses 35 minutos, se ela parar de chiar, a esterilização deverá ser refeita ou o tempo em que ela ficou sem pressão deve ser compensado.
Após o tempo deixe a panela esfriar naturalmente, não abra a válvula deixando a pressão sair e nem tente jogar água nos potes para esfriar eles, isso causará um choque térmico.
Eu havia dito "tentar" pois a placa em questão está com diversos setores contaminados, fazendo com que seja mais arriscado tentar utilizá-la, sei que o certo seria "limpar" o micélio utilizando mais placas e setorização, no entanto, não vou fazer isso.
Segue foto da placa:
Antes de tudo, balance bastante sua CL (isso irá oxigenar o meio).
Primeiro passo é limpar sua SAB (esse procedimento é praticamente impossível sem uma SAB), borrife água sanitária diluída e esfregue todo o interior da SAB, espere cerca de 30 minutos e depois coloque tudo oque vc irá usar dentro dela, feche e borrife álcool 70% dentro dela (jogue com abundância em tudo, no ar, paredes, objetos que vão ser usados.).
Coloque sua máscara e suas luvas (limpe as luvas com álcool 70% em abundância).
Espere cerca de 1 minuto com a mão fora da SAB antes de começar, pegue seu bisturi e flambe ele (deixe ele no fogo até que fique incandescente), espere 5 segundos para que ele esfrie e faça repartições no agar da placa (caso vá inocular apenas 1 Cultura, corte apenas um pedaço), feche a placa, deixe o recipiente da CL com a tampa frouxa (não abra), flambe seu bisturi e espere 5 segundos para que ele esfrie, abra sua placa e com a ponta do bisturi pegue um pedaço e jogue dentro da sua CL (quanto menos vc abrir a tampa e quanto menos tempo vc demorar, menor o risco de contaminações).
Essas são as reparticões q eu havia dito e os pedaços de agar faltando foram inoculados.
Evite ao máximo fazer movimentos rápidos e bruscos, o intuito da SAB é ser uma Still Air Box "caixa de ar imóvel", fazer movimentos bruscos movimenta muito o ar e joga contaminantes para todos os lados, acabando com o intuito dela.
No meu caso deixo elas em uma estufa caseira a cerca de 27,5 graus.
A temperatura da incubação é o principal fator que determina a velocidade de crescimento do micélio, quanto mais quente, mais ativo o metabolismo dele vai estar e mais rápido ele irá crescer.
Em cerca de 24 horas (dependendo da temperatura) vc poderá ver uma nuvem ou raízes surgindo do pedaço inoculado ou flutuando no meio (caso tenho inoculado com uma CL).
A cultura deve ser balançada diariamente após os 2 primeiros dias de incubação, isso ajuda a oxigenar o meio (evite balançar muito fortemente, mas tambem não balance muito levemente)
Seu micélio deve ter essas caracteristicas: Deve ser branco (com uma leve tonação dependendo da strain), deve parecer uma "nuvenzinha" ou um conjunto de "raizes finas"; normalmente tem um cheiro levemente doce de terra ou de cogumelo fresco.
Caso observe algum dos sinais que irei citar, descarte a cultura:
Caso tenha dado tudo certo e a CL não apresente sinais de contaminação, vc deve esperar até que ela chegue ao "ponto certo" para utilizar ela; no entanto o "ponto certo" da cultura liquida não é algo que se possa dizer, é algo que se observa visualmente, no entanto, no geral posso dizer que uma cultura está idealmente boa quando; ao balançar o frasco e quebrar o micélio, tenha pedaços cobrindo todo o liquido, deve haver MUITOS pedaços flutuando no meio, com pouco espaçamento entre eles.
Para aspirar sua CL, vc deve fazer o mesmo procedimento de inoculação, mas invés de injetar a CL, vc irá puxar ela.
No final vc deverá ter algo parecido com isso:
Essa CL está guardada a um certo tempo, então não se assuste se a sua estiver diferente (alguns fatores alteram o aspecto da CL, como a strain, meio de cultura, tempo de armazenamento, quanto tempo faz desde que o micélio foi quebrado, etc).
Enfim, acho que abordei tudo oque precisava ser abordado, desculpe se o texto estiver com erros, palavras repetidas ou muito estiver muito informal, tentei passar meu conhecimento do jeito mais técnico possivel, mas de uma forma que ficasse descontraída e fácil de entender; caso tenha dúvidas, pode responder a esse tópico que irei tentar te ajudar.
E desculpe pela qualidade das imagens, meu celular caiu na privada e desde então estou usando um motorola da primeira guerra mundial que tem a câmera péssima.
Desde já agradeço por terem lido, espero ter ajudado <3
Ingredientes:
Culturas liquidas podem ser feitas com diversos ingredientes, basicamente tudo oque você precisa é de algo q seja uma fonte de açúcar para o micélio, no entanto, diversos ingredientes causam uma turbidez no meio de cultura, característica essa que dificulta a visualização do micélio e principalmente a presença de contaminantes; dito isto, podemos afirmar que no geral uma boa cultura liquida é um meio que forneça açúcar/energia para o micélio poder se desenvolver, mas também consiga manter uma certa limpidez.Obs: No geral, usar apenas açúcar funciona muito bem, no entanto, fornecer nutrientes além do açúcar é desejável se quiser manter o micélio com o máximo de vitalidade possível, isso pode ser alcançado com alguns ingredientes de fácil acesso.
Podemos citar os principais ingredientes usados para a produção de uma CL:
- Dextrose : É praticamente o mesmo que a Glicose, ambos podem ser utilizados, no entanto, para a produção de culturas a dextrose é muito mais utilizada; é utilizado por ser de fácil acesso e baixo custo, considero ela A ou UMA DAS melhores opções. (Ela não possuí nada além de açúcares.)
- Água de batata : É a água resultante da fervura de batatas, ela é muito completa, possui açúcares, nutrientes e tudo que o micélio precisa; é uma das melhores opçoes, no entanto, dependendo da concentração, ela pode deixar o meio turvo.
- Mel : O mel é uma dos ingredientes mais usados para fazer CL's, além de conter açúcares, possuí minerais, vitaminas e nutrientes. No entanto, eu pessoalmente nunca gostei do mel por conta da turbidez q ele causa no meio e os resíduos insolúveis que se depositam no fundo. (isso depende da qualidade do mel também, eu utilizei os mais baratos)
- Karo (xarope de milho) : É muito mais utilizado na gringa do que no Brasil, no entanto, creio que também é uma das melhores opções para CL's. (Não possuí nada significativo além de açúcares.)
Recipiente:
É onde vc irá armazenar a cultura, basicamente pode ser qualquer recipiente que consiga suportar um calor de +120 graus e que tenha uma boa vedação. Vc deve fazer dois furos na tampa dele, um para a instalação de um filtro de ar e outra para inocular sua CL.- Furo : Pode ser usado qualquer material que filtre bem o ar e que suporte altas temperaturas (+120 graus), alguns exemplos de materiais são: fita microporosa (micropore), perlon (lã acrílica), filtro hepa, filtro EPTFE, entre outros, no geral apenas foque em algo que evite a entrada de contaminantes e ainda assim consiga fornecer oxigênio dentro do recipiente (o micélio necessita de POUQUÍSSIMO oxigênio nessa fase, ou seja, a troca gasosa deve ser bem pequena para diminuir o risco de possíveis contaminações.
- Furo : É utilizado para inocular a sua cultura com menor exposição a contaminantes, normalmente utilizando uma borracha de penicilina, esse furo é totalmente opcional, mas é extremamente recomendado para iniciantes, pois inocular culturas liquidas abrindo o recipiente exige muita técnica e assepsia e é praticamente impossível sem uma SAB ou Fluxo Laminar.
Segue foto de um recipiente adequado para CL's:
Nesses recipientes foram utilizados apenas vidros de azeitona, borrachas de penicilina e filtros adesivos que podem ser achados facilmente na internet por um preço acessível.
Produção da cultura líquida:
Após ter escolhido o ingrediente e recipiente, vamos preparar ela, no entanto, confira se possui tudo oque é necessário antes, segue a lista:- Recipiente próprio para a CL
- O ingrediente que vai compor a CL
- Água filtrada e fervida (pode ser só filtrada)
- Pedaços de vidro ou bolinhas de gude (opcional, mas MUITO recomendado)
- Balança de precisão (Usarei isso neste tutorial)
- OU
- Recipiente Graduado (Não vou abordar isso neste tutorial, pois o método é um pouco diferente)
- Papel Alumínio
- Panela de pressão
- Pano ou grade para colocar no fundo da panela de pressão (para que os recipientes não encostem diretamente no fundo da panela)
- Fogão ou algo que consiga esquentar a panela de pressão ao ponto dela "chiar"
- Relógio ou algo para cronometrar o tempo
Para começar, após ter decidido quantas ml de cultura liquida quer fazer, pegue essa mesma quantidade de água e passe por um filtro de papel ou de café (muito bem lavado para não conter impurezas), passe cerca de 2 a 3 vezes e dps ferva (tome cuidado para que ela não ferva por muito tempo, pois com isso a água irá evaporar e consequentemente terá menos água para diluir os ingredientes, deixando a CL mais concentrada do que deveria), após ferver, coloque em um recipiente MUITO limpo para não deixar a água com impurezas.
Em seguida, com a água ainda quente, misture o ingrediente na concentração adequada; nesse caso usarei dextrose em uma concentração de 0,9%;
No total fiz 3 frascos de CL, cada um contendo 200ml, totalizando 600ml, ou seja, 0,9% de 600 é 5,4; então tenho que diluir 5,4 gramas de dextrose em 600ml de água, segue um "diagrama" para facilitar o entendimento:
0,9% = Concentração fixa de dextrose que a solução deve ter
600ml = Volume Total de água
200ml = Volume em cada um dos potes que estou fazendo (totalizando 200)
600 x 0,009 = 5,4 ----> 5,4 gramas de dextrose diluídos em 600ml de água
600ml de Cultura liquida ----> 600/3 = 200ml em cada pote
Após o preparo da solução, passe ela em um filtro despejando ela nos recipientes (filtrar novamente serve para filtrar partículas e impurezas da dextrose que não se dissolveram na solução)
Antes ou após colocar a solução nos potes, coloque pedaços de vidro ou bolinhas de gude dentro do recipiente (isso ajuda a quebrar o micélio em fragmentos menores, ajudando na colonização e posteriormente na aspiração da CL).
Obs: Elas devem estar completamente limpas, lave diversas vezes e tenha certeza de não haver nenhum resquício de sujeira neles antes de colocá-los na CL)
Segue fotos de como sua solução deve estar:
Repare em como a solução está límpida, sem partículas suspensas no meio e nenhum tipo de turbidez.
Esterilização:
Após o preparo dos potes com a Cultura Liquida, é necessário esterilizar eles para que apenas o nosso micélio cresça; para isso você vc deve cobrir a tampa dos potes com papel alumínio, eles devem ficar assim:O elástico é opcional.
Após isso, pegue sua panela de pressão, coloque um pano no fundo dela e encha cerca de 4 a 5 dedos de água; coloque os potes dentro da panela e feche.
Ligue no fogo alto e deixe assim até que a panela comece a chiar fortemente, após isso deixe no fogo baixo por cerca de 35 minutos contando desde quando a panela pegou pressão e começou a "chiar".
Obs: a panela deve estar "chiando" durante esses 35 minutos, se ela parar de chiar, a esterilização deverá ser refeita ou o tempo em que ela ficou sem pressão deve ser compensado.
Após o tempo deixe a panela esfriar naturalmente, não abra a válvula deixando a pressão sair e nem tente jogar água nos potes para esfriar eles, isso causará um choque térmico.
Inoculação:
A inoculação da CL é a introdução do micélio ao meio de cultura por meio de fragmentos de cogumelos, placas de petri, culturas liquidas ou esporos; nesse tutorial iremos tentar usar uma placa de petri inoculadas com esporos de TAT (True Albino Teacher, logo mais farei um tópico explicando como extrair esporos de strains consideradas "estereis").Eu havia dito "tentar" pois a placa em questão está com diversos setores contaminados, fazendo com que seja mais arriscado tentar utilizá-la, sei que o certo seria "limpar" o micélio utilizando mais placas e setorização, no entanto, não vou fazer isso.
Segue foto da placa:
Materiais e instrumentos necessários:
- Água sanitária diluída
- Alcool 70%
- Luvas e mascara
- Bisturi
- Fonte de fogo (Isqueiro, lampada a álcool, etc)
Antes de tudo, balance bastante sua CL (isso irá oxigenar o meio).
Primeiro passo é limpar sua SAB (esse procedimento é praticamente impossível sem uma SAB), borrife água sanitária diluída e esfregue todo o interior da SAB, espere cerca de 30 minutos e depois coloque tudo oque vc irá usar dentro dela, feche e borrife álcool 70% dentro dela (jogue com abundância em tudo, no ar, paredes, objetos que vão ser usados.).
Coloque sua máscara e suas luvas (limpe as luvas com álcool 70% em abundância).
Espere cerca de 1 minuto com a mão fora da SAB antes de começar, pegue seu bisturi e flambe ele (deixe ele no fogo até que fique incandescente), espere 5 segundos para que ele esfrie e faça repartições no agar da placa (caso vá inocular apenas 1 Cultura, corte apenas um pedaço), feche a placa, deixe o recipiente da CL com a tampa frouxa (não abra), flambe seu bisturi e espere 5 segundos para que ele esfrie, abra sua placa e com a ponta do bisturi pegue um pedaço e jogue dentro da sua CL (quanto menos vc abrir a tampa e quanto menos tempo vc demorar, menor o risco de contaminações).
Essas são as reparticões q eu havia dito e os pedaços de agar faltando foram inoculados.
Evite ao máximo fazer movimentos rápidos e bruscos, o intuito da SAB é ser uma Still Air Box "caixa de ar imóvel", fazer movimentos bruscos movimenta muito o ar e joga contaminantes para todos os lados, acabando com o intuito dela.
Incubação:
É a fase onde o micélio estará crescendo/colonizando o meio; você apenas precisa deixa-lo em um local sem circulação de ar e com temperaturas entre 24 a 27 (no minimo 22 e no máximo 28), não deixe em locais com oscilações bruscas de temperatura. (de preferência deixe em um local escuro, mas não é algo obrigatório)No meu caso deixo elas em uma estufa caseira a cerca de 27,5 graus.
A temperatura da incubação é o principal fator que determina a velocidade de crescimento do micélio, quanto mais quente, mais ativo o metabolismo dele vai estar e mais rápido ele irá crescer.
Em cerca de 24 horas (dependendo da temperatura) vc poderá ver uma nuvem ou raízes surgindo do pedaço inoculado ou flutuando no meio (caso tenho inoculado com uma CL).
A cultura deve ser balançada diariamente após os 2 primeiros dias de incubação, isso ajuda a oxigenar o meio (evite balançar muito fortemente, mas tambem não balance muito levemente)
Seu micélio deve ter essas caracteristicas: Deve ser branco (com uma leve tonação dependendo da strain), deve parecer uma "nuvenzinha" ou um conjunto de "raizes finas"; normalmente tem um cheiro levemente doce de terra ou de cogumelo fresco.
Caso observe algum dos sinais que irei citar, descarte a cultura:
- Cores estranhas
- Turbidez
- Bolhas que permanecem por horas dps de mexer a CL
- Formação de um liquido expesso
- Cheiro podre, azedo ou de fermentação
Caso tenha dado tudo certo e a CL não apresente sinais de contaminação, vc deve esperar até que ela chegue ao "ponto certo" para utilizar ela; no entanto o "ponto certo" da cultura liquida não é algo que se possa dizer, é algo que se observa visualmente, no entanto, no geral posso dizer que uma cultura está idealmente boa quando; ao balançar o frasco e quebrar o micélio, tenha pedaços cobrindo todo o liquido, deve haver MUITOS pedaços flutuando no meio, com pouco espaçamento entre eles.
Para aspirar sua CL, vc deve fazer o mesmo procedimento de inoculação, mas invés de injetar a CL, vc irá puxar ela.
No final vc deverá ter algo parecido com isso:
Essa CL está guardada a um certo tempo, então não se assuste se a sua estiver diferente (alguns fatores alteram o aspecto da CL, como a strain, meio de cultura, tempo de armazenamento, quanto tempo faz desde que o micélio foi quebrado, etc).
Enfim, acho que abordei tudo oque precisava ser abordado, desculpe se o texto estiver com erros, palavras repetidas ou muito estiver muito informal, tentei passar meu conhecimento do jeito mais técnico possivel, mas de uma forma que ficasse descontraída e fácil de entender; caso tenha dúvidas, pode responder a esse tópico que irei tentar te ajudar.
E desculpe pela qualidade das imagens, meu celular caiu na privada e desde então estou usando um motorola da primeira guerra mundial que tem a câmera péssima.
Desde já agradeço por terem lido, espero ter ajudado <3
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