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Isolando a Sub-variedade rizomorfica (PESA) em petri usando BDA (AGAR)

bufoalvarius

Cogumelo maduro
Membro Ativo
20/11/2006
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Introdução

Psilocbe cubensis são cogumelos cosmopolitas, ou seja, sao encontrados em praticamente todas as regiões do globo. (Stamets, P e Chilton, J.L., 1983). São frequentemente encontrados em areas tropicais, mas podem tbm ocorrer em regiões temperadas.
Diversas variedades “raças”, ou sub-especies de P.cubensis ja foram descritas em todo mundo (Ver: https://teonanacatl.org/guia-de-racas ). Essas variedades, são muitas vezes definidas pela sua distribuição espacial ou area de ocorrência, podendo elas apresentar caracteristicas bastantes distintas na morfologia do basidio. A coloração do pileo, a forma arrendonda e ponteada e o tamanho são algumas dessas variedades morfologicas. O micelio tbm pode apresentar algumas diferenças na forma de crescimento e as propriedades bio-quimicas tbm pode variar entre as variedades de P.cubensis (Stamets, P. e Chilton, J.S., 1983 ; Tsujikawa Kenji et al, 2003).
Alem das variedades, pode-se encontrar sub-variedades dentre as variedades de P. cubensis. Por exemplo, uma variedade como Gold-teacher “GT” pode apresentar sub-variedades rizomorficas e algodoado no crescimento do micelio. Cultivadores de cogumelos notaram que, a sub-variedade rizomorfica do micelio possui crescimento mais acelerado, uma maior produtividade e “frutos”maiores, ou mais “sadios” (https://teonanacatl.org/threads/iso...ram-alguma-vantagem-real-de-isolamentos.1126/).
O objetivo principal, desse presente cultivo eh isolar a sub-variedade rizomorfica da variedade PES Amazonica (PESA) a partir de muitliesporos em meio liquido, para obter futuramente uma produçao maior, mais acelerada e com maiores frutos, e consequentemente, um melhor genotipo. O resultado desse cultivo tbm podera ser utilizado futuramente para comparar se realmente existe diferenças vantajosas no cultivo da sub-variedade rizomorfica sobre a sub-variedade algodoada.

Material e Metodos

Os esporos de P. cubensis da variedade PESA foram adquiridos atraves do Free Spore Ring bla bla bla... (FSR...). Foram hidratados em agua para preparo de injeções (AI), vendido em farmacias especializadas (nao sei se tem alguma diferença da agua destilada), e por ultimo armazenados em seringas de 8ml. A mistura da agua e esporos foi feito em tubos coletores para exames de fezes estereis.

Depois de 36horas de hidrataçao foi observardo uma massa de micelios aglomerados na agua (AI) dentro da seringa.

Os esporos hidratados foram inoculados no dia 19-12-2007 em um meio de batata dextrose e agar (BDA) em placas de petri descartaveis e estereis (10 placas), encontrados em lojas de produtos biologicos por R$ 3,00 - 10 placas. O meio de BDA foi esterelizado em panela de pressao por 1 hora em dois tubos Erlenmeer de 250ml com tampas feitas de algodao e gase. Foi utilizado uma alça de Trigalsk para promover o esfregaço dos esporos na placa, ou espalhar os esporos de forma homogenea na placa. Todo esse procedimento foi realizado em um ambiente previamente esterelizado com Lsol e com o auxilio de lamparina, luvas sirurgicas, toca, mascara, alcool e depois de um bom banho.

Apos a colonizacao 100% das 10 placas de petri, que durou 20 dias, mais 14 placas BDA foram elaboradas usando a mesma metodologia do dia 19-12-07.

Das 10 placas colonizadas, duas foram selecionadas por apresentarem areas com micelio mais rizomorfico. Nestas duas placas, as partes que continham micelio rizomorfico foram utilizadas para inocular as outras 14 placas de petri feitas no dia 08-01-2007. SOMENTE A PARTE RIZOMORFICA FOI RETIRADA E UTILIZADA NA INOCULACAO.

A inoculacao ocorreu no dia 08-01-2007 e foi feita sob os mesmos procedimentos de assepsia (lamparina, lsol, mascara, luvas, alcool, pinça com ponta, etc...). Pedaços de + ou – 1,5 cm X 1,5 cm, que continha micelio rizo, foi retirado e inoculado nas placas.

Resultados e discussão

De todas as placas feitas (n=24), apenas tres (n=3) apresentaram contaminaçao, uma (1) por fungo preto nao identificado, que foi logo tomado pelo micelio de P. cubensis e outras duas por bacteria, sendo que a primeira contaminaçao ocorreu na primeira inoculacao das placas e as duas ultimas ocorreu na segunda incoculação.
O crescimento do micelio nas 10 primeiras placas de petri, usando multiesporos hidratados, apresentaram crescimento algodoado com pedaços rizomorficos e tbm pequenos pedaços com crescimento linear. Nas outras 14 placas, inoculadas com os pedaços rizomorficos das 2 placas selecionadas, apresentavam crescimento bem mais rizomorfico do que aqueles vistos nas 10 primeiras placas, entretanto pode-se ainda observar pequenas partes do micelio algodoado nestas placas.

Apesar de somente as partes mais rizomorficas do micelio serem selecionadas e inoculadas, esses pedaços ainda sim continham PEQUENAS, ou resquisios de micelio algodoado. Portanto, o genotipo algodoado foi inoculado na placa e por isso eh necessario que o processo de isolamento seja repetido mais vezes para que se possa obter um genotipo 100% rizomorfico e assim poder realmente comparar, em experimentos futuros, se existe diferenças nas qualidades dessas sub-variedades.

Agradecimentos

Gostaria de agradecer aos administradores do Forum CM por abrir a oportunidade de leigos no cultivo de cogumelos, como EU, aprender muito e poder postar experiencias, e dessa forma contribuir e ampliar o conhecimento no cultivo (espero que isso sirva para alguma coisa). Gostaria tbm de agradecer, principalmente, os cultivadores Mauricio, Boca e Psilocbec, por estarem sempre contribuindo, ou ter CONTRIBUIDO de forma efetiva no forum. E tbm todos aqueles que cultivam e postam suas experiencias afim de compartilhar esse conhecimento que eu tanto admiro.

* TODAS as referencias citadas podem ser encontradas na WEB.

Fotos: Da direita para Esquerda - multiesporos em AI depois de 36 horas, Resumo do material (tbm inoculei P. sajor-caju em 3 placas), AI e tubo coletor, algumas placas multiesporos do dia 19-12-06.

*Esta experiência foi feita por um Amigo De Um Amigo (ADUA)!:)
CL.JPGmaterial2.JPGmaterial3.JPGplaca1-18-12-06.JPG
 
Última edição por um moderador:
FOTOS da segunda inoculação:

Da Diereita para Esquerda: Placas com o micelio rizomrofico selecionado, Placas com micelio selecionado (duas primeiras com contaminação bacteriana (em cima e abaixo)), placas com o micelio rizo e tbm um teste com papelao inoculado no mesmo dia (08-01-07), meu AVATAR.
placa2-08-01-07.JPGplaca08-01-07.JPGplacapapalao.JPGbufo-02-2004.jpg
 
Otimo trabalho de pesquisa!

Alguns pontos a ponderar:
Resultados e discussão

1- De todas as placas feitas (n=24), apenas tres (n=3) apresentaram contaminaçao, uma (1) por fungo preto nao identificado, que foi logo tomado pelo micelio de P. cubensis e outras duas por bacteria, sendo que a primeira contaminaçao ocorreu na primeira inoculacao das placas e as duas ultimas ocorreu na segunda incoculação.


2- O crescimento do micelio nas 10 primeiras placas de petri, usando multiesporos hidratados, apresentaram crescimento algodoado com pedaços rizomorficos e tbm pequenos pedaços com crescimento linear. Nas outras 14 placas, inoculadas com os pedaços rizomorficos das 2 placas selecionadas, apresentavam crescimento bem mais rizomorfico do que aqueles vistos nas 10 primeiras placas, entretanto pode-se ainda observar pequenas partes do micelio algodoado nestas placas.

3 - Apesar de somente as partes mais rizomorficas do micelio serem selecionadas e inoculadas, esses pedaços ainda sim continham PEQUENAS, ou resquisios de micelio algodoado. Portanto, o genotipo algodoado foi inoculado na placa e por isso eh necessario que o processo de isolamento seja repetido mais vezes para que se possa obter um genotipo 100% rizomorfico e assim poder realmente comparar, em experimentos futuros, se existe diferenças nas qualidades dessas sub-variedades.

1- Pelo que vi pelas fotos você nao trabalha em ambiente estéril, neste caso podemos considerar o resultado como PERFEITO.
Em ambos os casos a porcentagem de sucesso é muito maior que o de erros.

2- Como foi feita a inoculaçao?
Me parece que você despejou várias gotas por cima da petri certo?
Nas proximas vezes que for trabalhar com multi esporos em placas petri, para adiantar seu trabalho, faça diluições maiores da seringa, e inocule 3 gotas somente por placa, efetuando um risco em Z na placa com algum objeto esterrilizado e cortante. nao se esqueça que o objeticvo é isolamento :pos:

3- Tente levar um cultivo adiante com esse micelio, e depois faça a "engenharia" reversa - isole um miclelio do interior da parede de um caule do cogumelo. isso deve lhe dar material isolado naturalmente, facilitando muito a sua pesquisa.
 
2- Como foi feita a inoculaçao?

Me parece que você despejou várias gotas por cima da petri certo?

Nas proximas vezes que for trabalhar com multi esporos em placas petri, para adiantar seu trabalho, faça diluições maiores da seringa, e inocule 3 gotas somente por placa, efetuando um risco em Z na placa com algum objeto esterrilizado e cortante. nao se esqueça que o objeticvo é isolamento :)

Boca a inoculação foi assima mesmo! Foi apenas usado 3 gotas de uma seringa mestre e logo depois a alça de trigalsk para efetuar o esfregaço dos esporos nas placas. Por isso cresceram assim tão homogeneos.
Experimentou ja usar varias gotas na inoculação, mas definitivamente nao eh bom!

*Creditos a ADUA
 
Última edição por um moderador:
Equanto a diluiçoes?
Pode tentar fazer diluiçoes maiores como utilizar somente 1/12 do print pra uma seringa de 20 ml.

Inocular 10 ou 12 placas novamente e nao fazer muito esfregaço e sim um LEVE sulco em Z mesmo ligando as 3 gotas,limitando o micelio a crescer a partir deste risco , isolando-se naturalmente a principio.
 
Essa eh uma BOA dica!:pos:
Fazer diluições maiores e esse sulco em Z, deve ajudar muito, nao só na observação do crescimento do micelio, mas tbm na seleção de partes mais rizomorficas!
:pos: Valeu!!!:pos:
 
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