Questões sobre contaminações e esterilização

[diegosf]

Olá pessoal, como vão vocês?
Depois de alguns problemas com contaminações em meus cultivos, principalmente na fase inicial (pré-incubação e incubação), tem me surgido algumas questões sobre as maneiras corretas de se realizar a esterilização e assepsia dos materiais que vão ser utilizados na inoculação, assim como tenho me indagado sobre a eficiência de algumas formas de se fazer isso.
Sei que já tem alguns tópicos no fórum sobre materiais e meios de se fazer isso, mas acredito que algumas de minhas dúvidas ainda persistem mesmo tendo lido quase todos os tópicos que falavam disso.

Vejamos, a primeira delas é a respeito de como vocês fazem para limpar a bancada em que trabalham, ou mesmo o interior da glovebox: que tipo de materiais usam e como procedem?
Sei que muitos usam álcool 70, mas vi que um colega do fórum teve problema com pegar fogo esses dias , existem alguns que usam Lysol ou uma solução com hipoclorito de sódio.
Mas enfim, a questão aqui, mais do que o tipo de produto utilizado, é:
COMO vocês fazem isso?
Espalham o produto de limpeza apenas e já começam? Ou esperam um tempo para agir? Deixam o líquido lá ainda enquanto começam o trabalho, esperam evaporar sozinho ou ainda passam algum tipo de pano/papel toalha?
Existe alguma diferença de eficácia na assepsia e na eliminação de microorganismos dependendo de cada uma dessas opções?

As vezes me pergunto se só passar o produto em cima já resolve o problema, porém me parece que não, precisaria limpar os resíduos com alguma coisa.. mas nesse caso, como ter certeza que o pano/papel toalha está bem limpo e livre de bactérias e esporos, e que não vá contaminar novamente o local em que foi passado o produto?

Essa pergunta se estende também aos potes que utilizam, por exemplo algum pote de cultura líquida que precisa ser "re-furado" para ser introduzido em uma nova seringa, ou mesmo os potes de grãos que são abertos para fazer um G2G, como os limpam por fora, que procedimentos vocês realizam, para evitar que contaminantes entrem na glovebox e até mesmo nos novos copos?

Tenho encontrado uma situação que me causa muita suspeita, pois as contaminações que me aparecem surgem exatamente nos pontos de inoculação, todas as vezes.
Já mudei de substrato, já testei potes de diferentes formatos, já utilizei vários tempos na panela de pressão, de 45min à 1h30, e ainda acabo encontrado esse problema.
O pior é que isso não ocorre em todas as vezes, alguns potes inoculados tem crescido que é uma beleza, sem nenhum problema aparente, por isso me parece possível eliminar a hipótese de que a cultura líquida ou que o interior das seringas estão contaminados.
Só me resta então acreditar que algo no momento da inoculação, dentro da glovebox, entre a retirada da agulha da embalagem, a flambagem, a injeção no furo do pote, e a retirada, pode estar ocorrendo de algum microorganismo entrar, seja por grudar na agulha pós-flambada (vindo do ar de dentro da glovebox), seja por ser introduzido junto (por estar na tampa) ao enfiá-la no substrato, ou alguma outra situação.

Enfim, se puderem me dar alguma luz a partir dos procedimentos que vocês realizam, e também alguma sugestão do que pode estar acontecendo com meus potes, agradeço imensamente!

Um abraço

 

[01101OK!]

Só adicionando meu palpite. Você que confecciona suas seringas? Se sim, qual a procedência do carimbo, qual o procedimento que você toma?

Imagina um carimbo feito a céu aberto, quanto contaminante e esporos não vão estar no carimbo. Dessa maneira, não tem cuidado de esterilização que dê conta, já que a própria fonte já tá contaminada. Por isso que na hora de fazer um carimbo, precisa de cuidado e controle de esterilização, porque se não dificulta muito.

Sobre como proceder com a glovebox, eu passo álcool 70%, coloco tudo que vai ser usado dentro da glovebox e deixo por alguns minutos, para o ar dentro dela se estabilizar. Você não quer fluxo de ar dentro da glovebox, por isso escolha um lugar que não tenha tanta corrente de ar. No inglês se usa a expressão "SAB - Still Air Box", ou seja, caixa de ar parado. Isso já garante uma segurança contra contaminantes, pois eles ficam voando no ar.

 

[Cebolo]

mas vi que um colega do fórum teve problema com pegar fogo esses dias

hhehhehe cara, apesar disso, continuo utilizando o álcool 70 e recomendo... foi descuido meu, deixei o papel molhado de álcool muito próximo do isqueiro... Contei esse relato mais como um aviso a todos pra tomarem cuidados


Eu faço da seguinte forma: tenho 1 borrifador com álcool 70 e outro com mistura agua+agua sanitaria e detergente.
primeiro limpo (com um pano) a caixa por dentro com a mistura de água sanitária e todos os objetos que vão pra ela, boto tudo dentro, borrifo mais da mistura, fecho e deixo decantar por 1h +/-, dentro da glove, vai o outro borrifador com alcool 70, após esperar 1h, eu boto as mãos na luva, borrifo tudo novamente com o alcool lá de dentro, borrifo minhas mãos, os potes, seringa, isqueiro, etc, e deixo umas 2 folhas de papel toalha dobrado (quando borrifar tudo, se não estiver dobrado vai molhar), utilizo o pape praticamente so pra secar o isqueiro pra fazer faísca, raro alguma coisa lá dentro que precise estar seco pro manuseio

 

[Grako]

Bom, acho que como tive uma apequena experiência boa posso dar uma opinada também já que dos meus 6 copos apenas um contaminou e foi algo bem sutil ^^

Como o @Cebolo falou acima, é só ter cuidado com o álcool haha (eu ri mas foi com respeito amigo )
Eu meio que faço de uma das parte do meu armário uma glove box, então primeiro esfrego bem lá dentro com uma mistura de água e água sanitária na proporção 1/3 (que já me falaram ser muito mas né, o seguro morreu de velho kk). Depois de bem esfregado, borrifei muito álcool lá dentro até saturar o ar, fechei a portinha do armário e deixei atuando por cerca de uma hora. Enquanto isso eu tomei o banho mais demorado da minha vida usando protex e aceptol. Sai daquele banheiro de um jeito que dava pra fazer uma cirurgia em cima de mim kkkkkk
Então na hora de fazer todos os procedimentos eu sempre usava máscara, luva e um gorro porque meu cabelo é grande hehe (ainda assim depois eu descobri que, mesmo tendo ficado saudável, um dos copos tinha um cabelo meu dentro )
Pra garantir mais, eu deixava uma vela acesa dentro do armário na hora que além de fornecer uma mini barreira de calor, ajudava a flambar as ferramentas
Tudo de material que usei, eu escaldei antes e na hora ainda dava um banho de álcool. Passava álcool nas mãos também a cada 10 minutos mais ou menos.
Ah, todas as janelas e portas fechadas é algo muito importante! basicamente isso foram todas as precauções que tomei ^^
Espero que você descubra a fonte de contaminação amigo :s

Boa sorte e um abração!

 

[mysticgrower]

Sou adepto da tecnica da boca do forno...
Faço uma gambiarra na chapa de metal que fica acima do fogo e isso direciona o calor direto na altura que vou trabalhar. Mais 5 velas acesas (2 em cada lado e uma em baixo de mim). Trabalho com o forno ligado e pré aquecido tambem pra dar uma esterilizada no forno, as vezes asso um pão antes de trabalhar com os cogus.
Alem disso tudo eu borrifo solução de agua+agua sanitaria (1 ou 2 colher de sopa por litro de agua) em tudo, no chão, no forno, dentro do forno, na tampa do forno, em cima do fogão, nas paredes, no chão, em tudo mesmo. Deixo agindo e vou tomar um banho caprichado no sabonete.
As vezes cubro a tampa do forno com papel aluminio (superfície de trabalho), para trabalhos mais delicados e cautelosos. Se for só inoculação as vezes faço na tampa do forno sem nada por cima.
Além dessa borrifada de agua sanitaria por tudo eu ainda borrifo alcool 70 na superfície de trabalho e em tudo que vou usar.
Luva + mascara + alcool 70 em todo procedimento na boca do forno.

Para encher os potes de substrato ou cozinhar os grãos só lavo as mãos e mais nada... agora na boca do forno o bagui é serio rs. Tem que estar ccompleto.

Esses dias borrifei alcool isopropilico na bancada e pegou fogo em tudo mas foi coisa rapida e já apagou kkkkk deu uma bela esterilizada na superfície. Perigoso
Sem falar no perigo de trabalhar nas velas, direto queima uns pelos dos braços, tem que esperar evaporar bem o alcool quando passa.

 

[Texugo]

Vou dar uma opinião diferentes das demais.

Não acho que seja necessário tanto cuidado, principalmente se for pftek com selo de vermiculita, faço assim pra spawn de milho também.

Meus primeiros cultivos eu inoculei na mesa do quarto, sem fazer nada e deram certo.

Agora, pra garantir, faço dentro do armário (com as roupas dentro mesmo), só dou uma borrifada com água da torneira, pra "descer" contaminantes que estejam no ar.

Já foram mais de 10 levas fazendo isso (mais de 100 copos) e se tive 3 copos contaminados foi muito.

O que eu sugiro mais do que qualquer coisa: utilizar água de copinho, lâmina de bisturi pra raspar o carimbo, seringa descartável, sempre limpar a tampa de alumínio ou plastico com álcool 70 antes de inocular e usar máscara para não movimentar muito o ar.

Não uso luva. (Só pra manusear os bolos colonizados)

E claro, meus carimbos fui eu quem tirei, então sei que estão limpos.

Assim funciona bem pra mim.

 

[mariafernnanda2]

Eu uso a mesa do quarto e a limpo com alcool 70 de Spray
Evito deixar materiais que n preciso naquele momento perto dos copos e carimbo
E mantenho o cuidado de passar álcool primeiramente na mesa sem nada em cima, depois nos copos, nas mãos e onde mais acho que precise...
Na hora de inocular é bom flambar a agulha a cada perfuração e fechar com 2 camadas de micropore
Depois de fechar, eu ainda jogo um alcool em cima e passo um papel ou deixo evaporar
Limpo também o interior da caixa q vai entrar os copos inoculados e o local que ela ficará... Só isso. Ainda n tive probema com contaminação gad
Espero que te ajude nos proximos cultivos

 

[diegosf]

Só adicionando meu palpite. Você que confecciona suas seringas? Se sim, qual a procedência do carimbo, qual o procedimento que você toma?

Imagina um carimbo feito a céu aberto, quanto contaminante e esporos não vão estar no carimbo. Dessa maneira, não tem cuidado de esterilização que dê conta, já que a própria fonte já tá contaminada. Por isso que na hora de fazer um carimbo, precisa de cuidado e controle de esterilização, porque se não dificulta muito.

Sobre como proceder com a glovebox, eu passo álcool 70%, coloco tudo que vai ser usado dentro da glovebox e deixo por alguns minutos, para o ar dentro dela se estabilizar. Você não quer fluxo de ar dentro da glovebox, por isso escolha um lugar que não tenha tanta corrente de ar. No inglês se usa a expressão "SAB - Still Air Box", ou seja, caixa de ar parado. Isso já garante uma segurança contra contaminantes, pois eles ficam voando no ar.

Olá @01101OK!
Então, na verdade para meu primeiro cultivo comprei algumas seringas já com cultura líquida de um site conhecido aí. Então não tive a etapa de contaminação que poderia vir da confecção do carimbo e da seringa, porém, como sabemos, a cultura pode vir contaminada desde a origem.
Não descarto essa possibilidade no meu caso, porém tive alguns potes que não contaminaram, e outros que sim, mesmo com a mesma seringa.. por isso fico em dúvida se pode acontecer disso, a seringa estar contaminada e mesmo assim os contaminantes não se desenvolverem em alguns dos potes.

Bom, acho que como tive uma apequena experiência boa posso dar uma opinada também já que dos meus 6 copos apenas um contaminou e foi algo bem sutil ^^

Como o @Cebolo falou acima, é só ter cuidado com o álcool haha (eu ri mas foi com respeito amigo )
Eu meio que faço de uma das parte do meu armário uma glove box, então primeiro esfrego bem lá dentro com uma mistura de água e água sanitária na proporção 1/3 (que já me falaram ser muito mas né, o seguro morreu de velho kk). Depois de bem esfregado, borrifei muito álcool lá dentro até saturar o ar, fechei a portinha do armário e deixei atuando por cerca de uma hora. Enquanto isso eu tomei o banho mais demorado da minha vida usando protex e aceptol. Sai daquele banheiro de um jeito que dava pra fazer uma cirurgia em cima de mim kkkkkk
Então na hora de fazer todos os procedimentos eu sempre usava máscara, luva e um gorro porque meu cabelo é grande hehe (ainda assim depois eu descobri que, mesmo tendo ficado saudável, um dos copos tinha um cabelo meu dentro )
Pra garantir mais, eu deixava uma vela acesa dentro do armário na hora que além de fornecer uma mini barreira de calor, ajudava a flambar as ferramentas
Tudo de material que usei, eu escaldei antes e na hora ainda dava um banho de álcool. Passava álcool nas mãos também a cada 10 minutos mais ou menos.
Ah, todas as janelas e portas fechadas é algo muito importante! basicamente isso foram todas as precauções que tomei ^^
Espero que você descubra a fonte de contaminação amigo :s

Boa sorte e um abração!

Legal @Grako, obrigado por compartilhar..
Parece que os procedimentos não são muito diferentes do @01101OK! e também dos que eu faço, limpar tudo com algum produto, saturar o ar dentro de um local fechado com ele, cortar correntes de ar..
O curioso é que por algum motivo acaba acontecendo de entrar algum contaminante pelo buraco da injeção..

Vou dar uma opinião diferentes das demais.

Não acho que seja necessário tanto cuidado, principalmente se for pftek com selo de vermiculita, faço assim pra spawn de milho também.

Meus primeiros cultivos eu inoculei na mesa do quarto, sem fazer nada e deram certo.

Agora, pra garantir, faço dentro do armário (com as roupas dentro mesmo), só dou uma borrifada com água da torneira, pra "descer" contaminantes que estejam no ar.

Já foram mais de 10 levas fazendo isso (mais de 100 copos) e se tive 3 copos contaminados foi muito.

O que eu sugiro mais do que qualquer coisa: utilizar água de copinho, lâmina de bisturi pra raspar o carimbo, seringa descartável, sempre limpar a tampa de alumínio ou plastico com álcool 70 antes de inocular e usar máscara para não movimentar muito o ar.

Não uso luva. (Só pra manusear os bolos colonizados)

E claro, meus carimbos fui eu quem tirei, então sei que estão limpos.

Assim funciona bem pra mim.

Interessante @Texugo, realmente parece acontecer de algumas pessoas não tomarem tantos cuidados e serem bem-sucedidos, e outros tão preocupados acabarem com contaminações..

Eu uso a mesa do quarto e a limpo com alcool 70 de Spray
Evito deixar materiais que n preciso naquele momento perto dos copos e carimbo
E mantenho o cuidado de passar álcool primeiramente na mesa sem nada em cima, depois nos copos, nas mãos e onde mais acho que precise...
Na hora de inocular é bom flambar a agulha a cada perfuração e fechar com 2 camadas de micropore
Depois de fechar, eu ainda jogo um alcool em cima e passo um papel ou deixo evaporar
Limpo também o interior da caixa q vai entrar os copos inoculados e o local que ela ficará... Só isso. Ainda n tive probema com contaminação gad
Espero que te ajude nos proximos cultivos

Obrigado @mariafernnanda2!

Depois de analisar bastante as situações, tanto as minhas passadas como as de vocês, chego à algumas hipóteses:
1. No primeiro dia que peguei as seringas tive receio de saturar o ar de álcool, pois ia acender o isqueiro dentro da glovebox, então só dei uma primeira limpada geral na caixa por dentro e nos copos, depois devo ter aberto mais uma vez a glovebox, talvez nesse momento algum contaminante tenha entrado ali e ficado preso, grudando na seringa, ou na boca do copo, e passando por dentro do selo de vermiculita.
2. Achei que não faria mal nenhum sugar um pouco do líquido que fica na agulha pra dentro da seringa, tanto assim que tirei da embalagem (tinha um pouco vazado na tampa da agulha), quanto depois de inocular, pra evitar que o mesmo evaporasse e fosse perdido para o além. Talvez essa vontade de economizar cultura sugando de volta fez com que entrasse algum contaminante logo nas primeiras inoculações, e se espalhado para todos os outros potes que inoculei com essa mesma seringa.
3. Como estou usando potes de plástico, os quais furei as tampas outrora para facilitar a inoculação sem precisar abri-las, tive que cobrir previamente com micropore os furos para saírem já protegidos. Ao inocular, apenas furei os micropores com a agulha, e introjetei até por baixo do selo de vermiculita. Sei que cutuquei o pote algumas vezes sem conseguir acertar os buracos, pois eram muito pequenos e não faziam saliência passível de ser vista por cima do micropore. Pode ser então que, assim como na primeira hipótese, por ter contaminantes no ar dentro da caixa, e por terem caídos na tampa, grudados no micropore por fora, ou algo assim, acabaram caindo junto pra dentro ao inserir a seringa, principalmente depois de cutucar algumas vezes erradas as bordas dos furos e do micropore. E aí depois sugadas novamente para dentro da seringa, para evitar o disperdício, como comentei na hipótese 2, contaminando totalmente o líquido.

Bom, são hipóteses apenas e irei testá-las:
1. Utilizando seringas novas e evitando esse comportamento (imbecíl) de sugar de volta
2. Limpando bem a tampa dos copos
3. Tirando o micropore do furo antes de inocular e depois inserindo novamente, para ficar mais fácil a visualização e ficar mais seguro.
4. Saturando o ar da caixa (não com álcool, mas com água sanitária)
5. Testando outros potes e outras tampas, como a tampa dupla de alumínio onde se inocula por baixo dela.

Bom, obrigado a todos pelas contribuições, farei os testes e volto com resultados!

 

[Enteogenesis]

A assepsia dos grãos é tão importante quanto.

Meus spaws estavam contaminando, todos. Fui aumentando cada vez mais a assepsia na inoculação e incubação, a ponto de fazer uma glovebox hermética com esterilização UV. E continuou, mesmo com 2hrs de PP.
Cheguei a conclusão que eram os grãos. Como?
Peguei 2 potes, fiz o processo de esterilização, 2hrs de PP, e mantive fechado, sem inocular nada. Em 20 dias estavam tomados de um fungo verde.

Passei a deixar 3 dias de molho em 2lts de água com 4 colheres de água sanitária. Trocando a água todo dia. Depois disso fervo com água pura pra tirar vestígios de água sanitária e levo pra PP por 1hr.
A contaminação caiu de 100% pra 20%, usando o mesmo processo de inoculação. Agora dá pra trabalhar.

A qualidade do milho de pipoca que comprei tá horrível, e foram 10 pacotes pq tava na promo. Ainda tem 6 alí.

 

[Cebolo]

A assepsia dos grãos é tão importante quanto.

Meus spaws estavam contaminando, todos. Fui aumentando cada vez mais a assepsia na inoculação e incubação, a ponto de fazer uma glovebox hermética com esterilização UV. E continuou, mesmo com 2hrs de PP.
Cheguei a conclusão que eram os grãos. Como?
Peguei 2 potes, fiz o processo de esterilização, 2hrs de PP, e mantive fechado, sem inocular nada. Em 20 dias estavam tomados de um fungo verde.

Passei a deixar 3 dias de molho em 2lts de água com 4 colheres de água sanitária. Trocando a água todo dia. Depois disso fervo com água pura pra tirar vestígios de água sanitária e levo pra PP por 1hr.
A contaminação caiu de 100% pra 20%, usando o mesmo processo de inoculação. Agora dá pra trabalhar.

A qualidade do milho de pipoca que comprei tá horrível, e foram 10 pacotes pq tava na promo. Ainda tem 6 alí.

Obrigado pela informação @JulioFerOli
Eu sempre tive problemas com fungo verde no milho, mesmo usando glovebox e 1h30 de PP, mesmo caso que você, vou testar esses 3 dias de molho em água c/ agua sanitaria, vlw

 

[Brunobf]

A assepsia dos grãos é tão importante quanto.

Meus spaws estavam contaminando, todos. Fui aumentando cada vez mais a assepsia na inoculação e incubação, a ponto de fazer uma glovebox hermética com esterilização UV. E continuou, mesmo com 2hrs de PP.
Cheguei a conclusão que eram os grãos. Como?
Peguei 2 potes, fiz o processo de esterilização, 2hrs de PP, e mantive fechado, sem inocular nada. Em 20 dias estavam tomados de um fungo verde.

Passei a deixar 3 dias de molho em 2lts de água com 4 colheres de água sanitária. Trocando a água todo dia. Depois disso fervo com água pura pra tirar vestígios de água sanitária e levo pra PP por 1hr.
A contaminação caiu de 100% pra 20%, usando o mesmo processo de inoculação. Agora dá pra trabalhar.

A qualidade do milho de pipoca que comprei tá horrível, e foram 10 pacotes pq tava na promo. Ainda tem 6 alí.

Deves moer os grãos de milho com serragem ou outra coisa antes de esterilizar pode ser no processador mesmo . Substrato deve estar com superfície de contato para expor os esporos ou seja bem moído.

 

[Texugo]

Deves moer os grãos de milho com serragem ou outra coisa antes de esterilizar pode ser no processador mesmo . Substrato deve estar com superfície de contato para expor os esporos ou seja bem moído.

Aí é melhor fazer pftek.

A ideia de utilizar grão é fazer bulk ou casing.
Se você fizer farinha com ele e misturar com serragem, vai virar um pftek modificado, que não tem as medidas pré definidas, vai ter que testar por conta.
Além de que a receita PFTek é a mais produtiva que você vai ter com farinha de arroz.
Uma das melhores coisas de utilizar grão é não misturar com vermiculita/serragem e perder espaço/proporção dentro do copo.
Se você fizer um copo de 500ml com grãos, vai ter 400ml de spawn, se misturar com serragem, vai ter uns 200ml de substrato nutritivo.
Com farinha vai ser dificil fazer g2g ou separar o bloco que formou.
E aí fica mais facil/barato/rápido só pasteurizar a mistura que for receber o spawn.

Durante o ciclo na panela de pressão, o vapor úmido vai deixar todo o substrato na temperatura de ~121 C, inclusive o interior, não sendo necessário estar processado.

O que acontece muitas vezes é que o pessoal esteriliza grãos e injeta multiesporos, que por natureza tem alguns contaminantes.
Por ser um substrato muito nutritivo, contamina facilmente com pouco contaminante.
Ou até erram na hidratação dos grãos e fica demais.

Via de regra, se quer usar grãos, precisa de uma cultura realmente limpa e essa é o principal erro de iniciantes, na maioria das vezes nem é a preparação do grão

 

[Ateruz]

agradeço