Completo Diário PF Tek B+: 1º inoculação e cultivo em meio alternativo.

Adquiri uma seringa de B+ e abri o diário como recomendado para exercitar as técnicas aprendidas através da leitura e estudo de outros diários aqui expostos e ser orientado sobre as melhores práticas durante o cultivo.

Acredito que com os conhecimento aqui adquiridos estou apto a iniciar meu cultivo e tenho certeza que se puder ser orientado, por aqueles que já trilharam o mesmo caminho, durante todo processo minhas chances de obter sucesso irão aumentar consideravelmente.

Dúvidas:
1) Considerando que irei usar agar e os procedimentos a seguir serão executados observando os protocolos de assepsia; entre usar a técnica de inoculação da 'porta do forno' (Eu quero saber - Faça suas perguntas aqui!) e a técnica de inoculação descrita em Tutorial - Glovebox sem trucidar uma caixa novinha e preparação da minha área de trabalho, qual destas apresenta menor risco de contaminação?
2) A adição de iodo ao álcool 70 (entre 8 e 12 ppm) poderia diminuir o risco de contaminação? O iodo iria evaporar como o álcool sem deixar resíduos prejudiciais ao desenvolvimento do micélio/bolo?

 

[l3th3]

Olá @novomapa
Seja bem vindo!

Sobre suas perguntas eu acho que Glovebox é a mais garantida.
Uma vez que vc higienize bem ela, e os materiais que vc vai usar, incluindo a seringa etc...
Mas acredito que pra manipulação seja melhor, fazer a seringa dos prints, etc...

Pra inocular no copo, eu acho o método do fogão ai mais rápido.
passa algodão com álcool onde vai perfurar a tampa, esterilize a agulha da seringa.sempre.
Acredito que muitos façam mesmo no fogo do fogão isso, e fecha com fita microporo os buracos logo em seguida, a ideia do fogão é que o ar quente é menos denso, então tende a subir, então o ar sempre sobe ao redor do fogo e consequentemente onde estão os copos, se há alguma particula suspensa no ar, ela tende a subir junto com o ar, e não acabar caindo encima da tampa, no instrumental ou pior ainda, dentro do furo da tampa. Rs

Sobre sua segunda pergunta, não sei o que dizer sobre o iodo, mas sei que vc pode usar água oxigenada, inclusive para higienizar, acredito que só álcool 70º por si só esterilize.

Espero ter ajudado a sanar suas dúvidas!
Nos mantenha informado sobre o andamento do cultivo.
Abraços e Boa Sorte.

 

[novomapa]

DIÁRIO DE CULTIVO:
STRAIN: B+, seringa multi esporos
PROCEDÊNCIA: Comprado de Manaus-AM

DIA 01:

1. Preparo do substrato (pf-tek-fai) e esterilização,
   
2. Preparo do meio agar para isolamento.

Os procedimentos descritos abaixo foram executados entre 8h e 13h de 20/07/2018 com temperatura mínima/máxima de 24°/28° e umidade mínima/máxima de 32%/26%.

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SUBSTRATO PARA COLONIZAÇÃO:
PF TEK (2 Vermiculita + 1 Farinha de arroz integral + 1 Água mineral garrafa) com selo de vermiculita.

MÉTODO DE PREPARAÇÃO DO SUBSTRATO:
Em uma bacia plástica foi adicionado duas medidas de vermiculita seca não esterilizada e uma medida de água mineral em garrafa, mexido com uma colher de metal e reservado. O arroz integral cru foi moído no liquidificador restando alguns grãos que não adquiriram consistência de farinha. Adicionado o arroz a pré mistura de vermiculita. Usando um funil plástico o substrato foi adicionado aos copos (05 americano = 180 ml + 01 de 260 ml) e selado com vermiculita. Em nenhum momento houve contato mãos/substrato, foi usado uma colher de metal e um funil plástico para adicionar o substrato/vermiculita nos copos.

SELAGEM DO SUBSTRATO:
Os copos foram selados com duas camadas de papel alumínio onde foi feito três furos cobertos por fita micropore, fixando a dupla camada de papel alumínio com fita crepe larga ao redor do copo; por fim foi adicionado a terceira camada de papel alumínio que ficou solta (foi amassada para baixo).

ESTERILIZAÇÃO E ARMAZENAMENTO DO SUBSTRATO:
A panela de pressão foi forrada com um pano de prato, inserido os seis copos no interior, fogo alto até pegar pressão; após fogo baixo por uma hora. Foi deixado resfriar por 12 horas em panela tampada com os copos no interior. Após os copos foram retirados e armazenados em caixa organizadora, sendo borrifado álcool 70 sobre os mesmos já dentro da caixa que foi tampada.O substrato será inoculado no dia seguinte, 24 h após a esterilização.

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ISOLAMENTO PARA COLONIZAÇÃO EM AGAR:
Controle (35 ml): 5 placas 60x15 em meio BDA (7 ml por placa);
Teste (35 ml): 5 placas 60x15 em meio BDA enriquecido com 10 mg de 4-HO-MIPT fumarato (7 ml por placa,).

PREPARAÇÃO DO MEIO BDA PARA COLONIZAÇÃO:
O meio de cultura foi mantido em banho-maria a 75°. Com uma seringa sem agulha foi sugado 7ml do meio e preenchido a primeira placa, embalando-a com papel alumínio e reservando-a; seguindo esse método foram confeccionadas as 5 placas controle e as 5 placas teste. Após concluído o preenchimento das placas elas foram armazenadas em caixa organizadora em temperatura ambiente, sendo borrifado álcool 70 sobre as mesmas, já dentro da caixa que foi tampada. O meio de cultura será esterilizado e inoculado no dia seguinte.
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[novomapa]

DIA 2:

ESTERILIZAÇÃO DO LOCAL, EQUIPAMENTOS E INOCULAÇÃO:
Processo iniciado as 9h (preparação do local, esterilização, aquecimento do forno, etc.) e finalizado as 10:30h com temperatura ambiente de 24° e 29% de umidade relativa.
Local da inoculação: Cozinha, na porta do forno. Foi usado seringa multi esporos.

DIFICULDADES:

1. Pude constatar que existe grande diferença entre ler os procedimentos no fórum e executa-los; faltou planejamento.
2. Para a próxima vez irei criar um checklist impresso descrevendo detalhadamente a sequência de todas ações a serem executadas.
3. Usei uma grande assadeira de alumínio na porta do forno para organizar todos materiais/utensílios porem estavam mal posicionados.
   
4. Não foi possível inocular as placas de petri, foram guardadas em um freezer. Somente poderei esterilizar/inoculá-las daqui a seis dias, próxima sexta-feira (pode haver algum problema?).

ERROS:

1. O telefone tocou durante o procedimento, interrompi para atende-lo. Na próxima vez deixarei o telefone desligado.
2. Não havia notado mas o vitro da cozinha não estava totalmente fechado, possivelmente houve entrada de contaminantes.

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[novomapa]

DIA 3

Esterilização das placas de petri/meio de cultura para inoculação:

Hoje retirei as placas de petri do congelador (compradas em: Placas de Petri PS Estéril - Indavidas) para esterilizar e inocular... Executei os procedimentos de assepsia do corpo, utensílios e do local, decidindo que seria mais prático esterilizar por 3 a 7 minutos usando o micro-ondas em potência alta (como vi aqui no fórum).

Tive uma triste surpresa: as placas se transformaram em um bolo retorcido de plástico e o meio de cultura secou e torrou.

Bem... Nem tudo que leio e deu certo para determinado membro daria certo para mim. Pelo menos aprendi que devo ter mais cuidado ao colocar em prática as coisas que leio aqui no fórum.

Existe algum segredo... como colocar um copo de água no micro-ondas?
Ou os relatos sobre esterilizar as placas em micro-ondas dizem respeito ao 'Vidro Borosilicato'?... Se assim for, como proceder para que o meio de cultura não seque, vindo a queimar (tempo, potência, etc.)?

 

[novomapa]

Dia 4: Sete dias após a inoculação.
Mesmo tendo cometido alguns erros que comprometeram a manutenção de um ambiente estéril durante a inoculação, hoje fui agraciado com o aparecimento de uma massa branca (micélio?) em um dos copos de 180 ml; não posso afirmar que seja micélio nem contaminação, pois não sei a diferença entre ambos.

Detalhe: antes os copos estavam na lavanderia, próximo ao piso (temperatura mais baixa?) e a dois dias foram colocados em local mais alto próximo a laje (temperatura mais alta?).

Estou animado. Até penso em fazer/inocular outros copos.
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[MadHatter]

Saudações terráqueo.

As seringas de esporos do maumau são ponta firme. Pode confiar em tudo o que vier de Manaus.

Brother, não tem como dar errado esse seu cultivo. Entrou em mínimos detalhes e está empenhado na assepsia.

Esses contratempos durante as tarefas quase todos aqui tem. Acredito que terá sucesso!

Se possível, poste umas fotos para vermos esse suposto micélio. Onde estão armazenados estes copos? Em que temperatura?

Peace bro'

 

[Prisiconauta]

Hoje retirei as placas de petri do congelador (compradas em: Placas de Petri PS Estéril - Indavidas) para esterilizar e inocular... Executei os procedimentos de assepsia do corpo, utensílios e do local, decidindo que seria mais prático esterilizar por 3 a 7 minutos usando o micro-ondas em potência alta (como vi aqui no fórum).

Cara, ja apanhei tanto dessas placas... hehe

Então, melhor esterelizar o BDA antes de colocar na placa. Acho q só as de vidro resistem a altas temperaturas.

Faz a mistura num pote maior que possa ser esterelizado na PP (ou no microondas se vc ja viu em algum lugar q funciona); depois q esfriar um pouco coloca na placa (elas ja vem esterelizadas, mas rola de limpar com alcool 70 antes).

Lacre as placas com um papel filme ou algo parecido pra evitar ressecar e contaminar. Depois que solidificar rola de inocular.

Pode ser que uma glovebox ou um comodo bem limpo seja o melhor lugar pra manipular as placas, nao sei qual a chance de contaminar com a tecnica do forno.

 

[novomapa]

Dia 5: Atualização:
Como não possuo glovebox, e por enquanto não pretendo esquartejar minha caixa organizadora, decidi investir em uma lâmpada germicida de 15 W (R$ 39,00 c/ reator). Se entendi corretamente o modo de ação/potência da lâmpada, são necessários 0,15 W/m3... Então 15 W seria suficiente para esterilizar minha cozinha inteira (logicamente vai haver áreas de sombra/riscos, como sob os móveis).

Mesmo aceitando que os erros são parte do aprendizado eu odiaria fracassar novamente com as Petris ou ser vítima de contaminantes.

Os aliados:

1. Álcool 70
2. Lisoform
3. Caixa p/ incubação de placas Petri
4. Água sanitária 1:10
5. Lâmpada UV 253.7 nm
6. Reator p/ lâmpada uV

Usando a lâmpada UV:
Embora a distância lâmpada/alvo também deva ser considerada, a maioria dos contaminantes podem ser neutralizados com 30 minutos de irradiação; como o seguro morreu de velho, deixei a UV limpar o local por 4 horas mudando o posicionamento da lâmpada a cada 30 minutos para irradiar todo local.

No forno, após a habitual esterilização química com água sanitária 10:1, seguido de lysoform aplicado com pincel e encerrado com álcool 70 para remover resíduos, também coloquei a lâmpada dentro do forno por 40 minutos para esterilizar utensílios, placas petri e o recipiente com agar que anteriormente havia sido esterilizado por 30 minutos em panela de pressão. Tem mais: não esqueci do banho com germicida, vedar portas/janelas e desligar o telefone.

Ambiente e operador esterilizados, iniciei inoculando 3 potes de 280 ml da semente de pássaros (4x painço, 2x niger, 1x alpiste) que havia preparado no dia anterior e mais 1 pote de milho fugini para teste, enquanto o agar solidificava, fato que ocorreu rápido e não precisei refrigera-lo. 10 placas petri foram inoculadas e lacradas com micropore. No final, todos meus meninos foram para o berço... só resta esperar acordarem.

 

[novomapa]

Sobre suas perguntas eu acho que Glovebox é a mais garantida.
Uma vez que vc higienize bem ela, e os materiais que vc vai usar, incluindo a seringa etc...
Mas acredito que pra manipulação seja melhor, fazer a seringa dos prints, etc...

Pra inocular no copo, eu acho o método do fogão ai mais rápido.

Serei obrigado a criar uma glove, existem procedimentos que se executados na boca do forno tem grande possibilidade de fracasso, apesar de ter gostado da boca do fogão pelo fato de oferecer maior liberdade de movimento.
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Saudações terráqueo.

As seringas de esporos do maumau são ponta firme. Pode confiar em tudo o que vier de Manaus.

Se possível, poste umas fotos para vermos esse suposto micélio. Onde estão armazenados estes copos? Em que temperatura?

maumau... Mestre é mestre,
Estava com dificuldade para inserir imagens, já me encontrei, na próxima postagem vou enviar imagens dos bolos e outros apetrechos (durante o dia, a câmera é uma negação a noite).
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Cara, ja apanhei tanto dessas placas... hehe

Então, melhor esterelizar o BDA antes de colocar na placa. Acho q só as de vidro resistem a altas temperaturas.

Faz a mistura num pote maior que possa ser esterelizado na PP (ou no microondas se vc ja viu em algum lugar q funciona); depois q esfriar um pouco coloca na placa (elas ja vem esterelizadas, mas rola de limpar com alcool 70 antes).

Lacre as placas com um papel filme ou algo parecido pra evitar ressecar e contaminar. Depois que solidificar rola de inocular.

Pode ser que uma glovebox ou um comodo bem limpo seja o melhor lugar pra manipular as placas, nao sei qual a chance de contaminar com a tecnica do forno.

Obrigado pela força; Já estou seguindo sua recomendação... como ainda tenho algumas placas em plástico PS estou fazendo alguns experimentos... as placas de borosilicato estão a caminho.

Quanto a usar micro-ondas... vou manerar, agora só usarei para aquecer o agar.

Na questão da esterilização, pelos relatos que li no fórum, tenho certeza que o risco de contaminação é menor em uma glovebox. Estou adiando a montagem de uma, se a esterilização via luz UV não vingar, futuramente serei obrigado a construir uma glove.

 

[novomapa]

Materiais adquiridos para meu cultivo com local da compra e valores.

China, site banggood (pagamento via boleto; entregou em 29 dias corridos - frete R$ 8,73):

• 1 un. Termômetro Higrômetro analógico (é necessário aferir/ajustar o higrômetro c/ sal de cozinha) R$ 23.94
• 1 un. Termômetro Higrômetro digital c/ sonda (3 leituras simultâneas: interior/exterior/média) R$ 27.06
• 1 un. Balança Digital máx. 50g., precisão 0,001g c/ capela (muito precisa, recomendo) R$ 139,90

Mercado Livre:

• 1 un. Timer c/ 18 Programações Bivolt (c/ bateria, não desregula se faltar energia) R$ 55,00 + frete
• 100 g. Agar neutro (agar impuro) R$ 39,80 + frete
• 1 un. Termômetro Culinário Digital Espeto Tp101, -50ºC a 300ºC (p/ medir pasteurização) R$ 17,00 + frete

Loja online Indavidas:

• 30 un. Placa Petri Descartável 60x15mm Estéril R$ 13,35 + frete
• 30 un. Placa Petri Descartável 90x15mm Estéril R$ 17,65 + frete

Loja online Lojanetlab:

• 20 un. Placa de petri 60x15 vidro borosilicato neutro - Marca VIDROSLAB (frete incluso) R$ 110,96

Loja local de aquários:

• 1 un. Aquecedor Com Termostato Atman - 150w/110v R$ 80,00
• 1 un. Compressor De Ar Big Air A230 - 2,5w/1,5 L. + porosa + mangueira R$ 49,00

Loja local de material elétrico (Kit esterilização UV - teoricamente esteriliza 100 m3 de ar):

• 1 un. Lâmpada flúor 15w germicida R$ 22,50
• 1 un. Reator flúor 20w R$ 13,50
• 2 un. Braçadeira de aço 34 mm R$ 2,00
• 2 un. Soquete flúor redondo R$ 1,50

Loja local de artigos para festa:

• Embalagem c/ 25 un. pote plaszom polipropileno PRD/ST/750 ml (vou testar se aguenta panela pressão) R$ 15,59
• 1 un. caixa isopor sorvete 1.000 g. (incubar placas petri, comporta 20 placas 60x15) R$ 2,59
• 2 un. potes PP Plasvale 450 ml c/ tampa (testei: usar s/ tampa na panela pressão pois deforma a tampa) R$ 7,00
• 4 un. copos vidro 280 ml. R$ 14,00
• 6 un. copos vidro 180 ml R$ 6,00

Loja local de agropecuária:

• Pó de coco mogifértil 40 L (aprox. 7 Kg.) R$ 27,00
• 2 Kg. Argila expandida R$ 11,00
• 2 L. Vermiculita fina expandida R$ 8,00

Consumíveis - farmácia

• 1 L. lysoform R$ 9,00
• 2 L. álcool 96 R$ 12,00
• 10 Luvas descartáveis R$ 0,70/par
• 10 Toucas descartáveis R$ 0,70 cada
• 10 Máscaras descartáveis R$ 0,70 cada
• Diversas seringas 10/20/30 ml., c/ agulha R$ 2,00 cada
• Iodo 2% R$ 5,00
• Fita microporosa 'Cremer' 2,5x450 cm. R$ 7,00
• Sabonete liquido germicida R$ 8,00

Outros:

• 2 un. vidro liso p/ cobertura do isopor (Vidraçaria) R$ 32,00
• 1 un. caixa organizadora PP colorida 'Agraplast' 55 L. (promoção Extra) R$ 35,00
• 1 un. caixa organizadora PP transparente 'Sanremo' 35 L. (promoção Extra) R$ 29,00
• 2 un. Caixas de isopor s/ tampa (loja de sucata/reciclagem) R$ 10,00
• 1 un. Fita crepe larga 50mmx50m (Adere) R$ 8,00
• 6 un. pincel 45 mm (para aplicar lysoform e tintura de iodo) R$ 18,00
• 2 un. borrifador 500 ml (p/ água sanitária e álcool) R$ 12,00
• 1 un. Papel alumínio 45cm x 7,5m (peguei na despensa)
• 1 un. Filme PVC 28cm x 30m (peguei na despensa)
• 1 un. papel toalha (peguei na despensa)
• Tinta epoxi base água p/ proteger caixa de isopor (em estoque)
• Fiação 2,5 mm, fita isolante, etc. (em estoque)
• 2 un. Plugue macho e tomada fêmea 10A 250V (em estoque)
• Colaboração/Boleto 28/07/18 R$ 50,00

As informações compartilhadas neste fórum, tempo, paciência, dedicação, empenho, muita água gelada e café s/ açúcar... 'isso não tem preço'!

Cada cultivo é único: De todo material listado acima penso que o compressor de ar não foi uma boa aquisição; quanto ao restante acredito que farei bom uso.
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[novomapa]

Estava estranhando meus potes/micélio não progredir... não estava usando termômetro na incubadora, confiava apenas no aquecedor com termostato ajustado para 29C. No dia 10/08 inventei de colocar a sonda na incubadora e descobri que o aquecedor estava com defeito, adquiri um novo e agora estou de olho. Comecei usar o novo aquecedor em 10/08 e pude notar uma sensível diferença no desenvolvimento do micélio.

Nas imagens abaixo os círculos de tinta preta mostram a posição do micélio em 10/08

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Aprendi mais uma lição: não confiar em um único instrumento de medição/controle.
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[LeonaLuna]

Ta equipado ein! Da pra fazer um trabalho muito bacana com os itens que citou acima.
Parabéns pelo carinho, dedicação e organização, aliás os últimos diários que li estavam todos muito bem organizados, to gostando de ver!
Vou ficar aqui de olho, acompanhando, esperando atualizações, abraço!

Só tenho a dizer que no caso das petris descartáveis elas normalmente já vem estéreis, vc então deve esterilizar o meio bda separadamente e colocar dentro delas em um ambiente limpo. Se esquenta as placas elas derretem msm.

 

[novomapa]

Estamos na reta final... mais alguns dias e vamos aniversariar os bolos.

Até agora dois potes (B+) contaminaram, mas o que não falta é pote colonizando na incubadora...

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@LeonaLuna
Agradeço pela dica do BDA; quanto as Petri já me apoderei de algumas de vidro boro e sobraram algumas de plástico/PS... como sou mão de vaca vou arranjar um meio de reutilizar/esterilizar.

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[novomapa]

Percebi que sem um controle de quente/frio/umidade seria complicado manter um terrário ou cumprir o compromisso de ficar abrindo/abanando/umidificando manualmente; não disponho desse tempo e as vezes me ausento por alguns dias.

Por hora congelei meus cultivos, até que o material de resfriamento esteja em minhas mãos. Falta apenas o chiller que está a caminho, quando recebe-lo irei reiniciar.
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A falta de material para controlar a frutificação abriu outras oportunidades...

Durante esse intervalo tenho conduzido diversas experiências de ambientação do micélio em água oxigenada em concentrações que variam de 0,018% (6 ml/litro) até 0,09%. Posso afirmar que obtive considerável sucesso, tanto no quesito ambientação como ausência de contaminantes (pelo menos visíveis).

Tenho testado diversas combinações de nutrientes e vitaminas em cultura liquida com pouco sucesso, após alguns dias a massa micelial para de crescer e permanece estagnada, mesmo injetando mais nutrientes.

Uma das combinações testada em CL foi descrita por Albert Hoffmann, Sandoz Ltd. (Patente EUA 3183172, 1959) "Obtenção Psilocibina e Psilocina de Material Fúngico"

Segundo a patente a melhor combinação de nutrientes para fermentação é a seguinte:
Glicose, Succinato de Amônio, Extrato de Levedura, Sulfato de Magnésio, Fosfato de Potássio, Hidrocloreto de Tiamina, Sulfato Ferroso, Sulfato de cobre, Heptamolibdato de amônio, Cloreto de manganês, Sulfato de zinco e Água.

Faltam apenas dois componentes que ainda não consegui.
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[novomapa]

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Pensei em reclamar da noite chuvosa...
até ensaiei,
pensei;
eis que ao visitar o jardim tenho grata surpresa, centenas delas...

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A natureza sabe cuidar das coisas...
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