Preparação dos Frascos, Esterilização e Inoculação

Coloque o meio em copos retos, de preferência transparentes e incolores, lisos, de vidro. A medida é a padrão para copos de água, cerca de 250 ml. Copos tão largos quanto compridos são melhores do que os mais compridos e finos. Coloque o meio sem compactar, bem aerado. Os espaços são importantes para o micélio crescer e para ter oxigênio para a fase inicial da cultura. Não encha até a boca do copo. Deixe sobrar 1 cm - 1,5 cm em cima sem meio, com o vidro bem limpo. Complete com vermiculita seca: ela faz de filtro, impedindo que muitos contaminantes alcancem o meio de cultura - é o selo de vermiculita. Tampe o copo com uma rodela de papel alumínio, feita com duas ou três folhas, com uma sobra lateral de 1 cm. Dobre a sobra lateral ao redor do copo. Não aperte muito a tampa.

Uma panela de pressão é essencial para a esterilização, e só falarei aqui sobre esse método de esterilizar. Coloque os vidros na panela, com água até metade da altura dos vidros. Esquente. Quando começar a soltar o vapor, abaixe o fogo para perder menos água e deixe esterilizar por 30 a 40 minutos. O vapor penetra pelas tampas e esteriliza eficientemente o meio. A esterilização com vapor e pressão é muito mais eficiente que a esterilização seca na mesma temperatura. Desligue o fogo e espere a panela esfriar. Abrir a panela quente fará os meios ferverem nos vidros. Prepare um rolo de durex ou fita isolante. Abra a panela, pegue rapidamente os vidros, sem deixar a tampa sair do lugar, aperte-as e vede-as em volta do vidro, usando a fita isolante ou o durex. Reserve os meios para a inoculação. Não pode haver água acumulada no fundo após esfriarem. A camada superior de vermiculita pura fica seca ou quase seca, com grãos soltos.

Deixe os vidros esfriarem completamente. Os esporos são muito sensíveis ao calor. O melhor lugar para fazer a inoculação é na tampa aberta de um forno quente. Se você decidir fazer assim esquente o forno em fogo alto por meia hora, depois abra a tampa e a use como uma bancada de trabalho. Cuidado para não se queimar, ou para não jogar algum desinfetante inflamável no fogo ou no metal aquecido. Se não for na tampa de forno use uma superfície que possa limpar bem, tipo uma fórmica. Evite ao máximo lugares sujos e correntes de ar. Esterilize antes o lugar com um desinfetante eficiente (Lysol,Lysoform, água sanitária). Esterilize a tampa e a vedação dos vidros com o desinfetante e um pano ou guardanapo limpo. Jogue duro. Contaminação é trabalho, dinheiro e tempo perdidos.

Prepare a seringa de esporos. É bom ter um chama acessa, para esterilizar a agulha a cada vidro inoculado. Também é bom recolocar a capa protetora da agulha a cada intervalo, ou a cada vidro. Balance bem a seringa, para dispersar os esporos por toda a água. Para inocular fure a tampa de papel alumínio com a agulha. Apoie a agulha contra o vidro, logo após a camada de vermiculita, e injete 0,25 ml. Pode ser difícil para você injetar uma quantidade pequena assim. Mas você pode comprar uma seringa vazia e treinar alguns dias antes. Faça 3 ou 4 inoculações por vidro. Logo após inocular tampe o furo com durex ou micropore.
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